GasBenchⅡ-IRMS测定葡萄酒水中δ18O方法研究

王道兵，钟其顶，高红波，程 涛，黄占斌

(1. 中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院，北京 100083；2. 中国食品发酵工业研究院，北京 100027；3.全国食品发酵标准化中心，北京 100027)

葡萄酒品质的优劣取决于是否用优质的原料酿制而成，是否在工艺过程中添加了禁用的添加剂。由于我国的葡萄原料供给不充裕，同时受当前检测技术水平的限制，还不能通过数据客观地反映这些指标，因此近年来屡有发生以半汁葡萄酒假冒全汁葡萄酒，产品年份、产地、品种乱标的现象，这严重违反了行业内的公平竞争，损害了行业利益，也给消费者带来了安全隐患。

稳定同位素技术的发展对于开展葡萄酒真实性鉴别具有重要意义[1-3]，尤其是葡萄酒水中氧同位素比值(δ18O)在产品掺水鉴别和产地溯源方面有很高的应用价值[4-12]。国际葡萄与葡萄酒组织(O.I.V)已制定了测定葡萄酒水中δ18O的标准检测方法[13]，然而，目前测定葡萄酒水中δ18O的标准方法主要为离线二氧化碳-水平衡法，该分析方法不仅存在样品量大、劳动强度大、对实验人员要求高等特点，且无法实现全自动进样、分析效率低，难以满足大规模连续测定，因此使得水中δ18O在葡萄酒真实性鉴别中的应用进展缓慢。近年来，在线二氧化碳-水平衡系统得到快速发展，Paul等[14]研究了不同因素对GasBench-IRMS测定二氧化碳中δ18O稳定性与准确性的影响，并对实验条件进行了优化；杜广鹏等[15]验证了排空时间对二氧化碳中δ18O测定稳定性和准确性的影响；孙青等[16]应用GasBench II-IRMS分析天然水样中δ18O，稳定性与准确性均比较理想；张琳等[17]对离线水平衡-双路进样法和GasBench II-IRMS法进行了比较，2种方法测定水中δ18O的精密度和准确度基本一致，均能得到较好的分析数据。

本研究通过优化方法参数，建立GasBench-IRMS测定葡萄酒水中δ18O的方法，探讨可大规模连续进样测定葡萄酒水中δ18O的在线分析技术，以用于葡萄酒掺水的鉴别。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

GasBench II前处理装置：GC PAL自动进样器，PoraPlot Q色谱柱(25 m×0.32 mm)，恒温样品盘(温度精度±0.1 ℃)，硼硅酸盐反应瓶(12 mL)，进样针和吹气针；Delta V advantage检测器：美国Thermo Finnigan公司产品，仪器控制软件为ISODATE 3.0。

主要试剂：高纯He、CO2标准气、0.3%CO2和He混合气，铜丝，活性碳粉末，乙醇(色谱纯)。

GasBench II-IRMS分析CO2气体中δ18O的精密度1σ<0.08‰，测定线性范围为1～10 V(信号强度)。

1.2 实验方法

设定恒温样品盘温度为27 ℃，He压力为80 kPa。在样品瓶中加入铜丝、活性碳和样品后，放入恒温样品盘中。固定进样针和吹气针，设定自动进样器程序，充入0.3%CO2和He混合气10 min，带走瓶中的空气。设定样品充气与样品分析之间的间隔，使气体CO2与水中氧发生同位素交换[18]。质谱仪测定平衡后CO2同位素比值。

1.3 数据校正

在样品测定过程中插入质控水样和标准水样，依据Stephen等[19]报道的VSMOW/SLAP校正法进行校正。

2 结果与讨论

2.1 影响因素分析

基于二氧化碳-水平衡法测定水中δ18O时，反应瓶气密性、反应时间、样品性质等均可能影响测定结果的有效性(以GasBench II-IRMS的测定精度0.15‰为评判基准)。

2.1.1反应瓶气密性 二氧化碳与水进行氧同位素交换时，即使采用振荡方式促进反应，也需5 h才能达到同位素交换平衡[13]。GasBench II-IRMS的优势是可一次性测定大量样品，然而由于GasBench II-IRMS是在静置状态下进行交换反应的，若此过程二氧化碳气体渗漏则可能出现同位素动力分馏，影响水中δ18O测定的准确性。

有研究[11]表明，超过24 h时，瓶内CO2中δ18O呈偏重趋势，即反应瓶气密性变化导致瓶内气体渗漏继而出现同位素分馏。本研究向26个反应瓶中充入0.3%CO2和He混合气，间隔2 h进行测定，结果示于图1。

各瓶中CO2的δ18O测定值的平均值为-1.03‰，SD为0.04‰(优于测定误差0.15‰)。从图1可以看出，52 h内，CO2的δ18O测定值仅在一定范围内(-0.94‰～-1.10‰)波动，没有出现越来越偏正的情况，说明本研究所用的反应瓶能够保证至少52 h内不出现同位素分馏现象。

2.1.2样品体积的影响 有研究[20]报道，样品水量为0.2、0.5、1 mL时，样品水中氢或氧的量远远超过平衡物质CO2物质的量，平衡体系中CO2的初始同位素比值对分析结果没有影响，即不同样品体积对水中氢、氧同位素分析结果没有明显的干扰。然而孙青等[16]研究表明，测定值会随样品体积的增大而逐渐偏负，并且样品水量较大时测量结果受体积的影响较小，而样品水量较小时受体积的影响较大，详细情况列于表1。

表1 样品体积对葡萄酒水中δ18O测定的影响Table 1 Influence of sample volume on δ18O of water in wine

本研究针对葡萄酒样品进行分析，结果表明，体积在200 μL时测定值的波动较大，而体积为500 μL时测定最稳定。对比不同体积时的平均测定结果，虽然呈增大趋势，但极差仅为0.16‰，与仪器测定误差(0.15‰)相近。这说明在葡萄酒分析中，样品体积在200～1 000 μL变化时不影响测定结果的准确性，但体积过小或过大时稳定性较差。

2.1.3平衡时间的选择 分别在12、16、20、24、32、40、48、72 h时测定，CO2/He混合气与水发生氧同位素交换，结果示于图2。反应时间在12～24 h时测得的氧同位素值比较偏负，且呈现逐渐偏正的趋势，这表明，水与CO2还未完全达到同位素平衡；而反应时间在24～72 h时测得的结果比较稳定，这说明当平衡反应进行24 h后开始测定是较适合的。

图2 反应时间对葡萄酒水中δ18O的影响Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O of water in wine

2.1.4乙醇对葡萄酒水中δ18O测定的影响

在葡萄酒中乙醇含量为7%～16%，GasBench II-IRMS采气时[11,17]，通过进样针用载气将反应瓶中的混合气体(CO2、水蒸气及其他)转移至IRMS中进行分析，若将乙醇带入IRMS中，由于乙醇的相对分子质量为46，势必会影响水中δ18O的测定。

为验证乙醇对δ18O测定的影响，配制体积百分比分别为0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，测定其水中δ18O，结果列于表2。结果表明，乙醇浓度在0～20%范围时，不影响水中δ18O测定的稳定性及结果准确性，因此GasBench II-IRMS法适合进行葡萄酒水中δ18O测定。

表2 乙醇水溶液中水的δ18OTable 2 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.2 方法稳定性

采用IRMS与GasBench II联用，利用CO2-H2O平衡在线连续分析葡萄酒水中氧稳定同位素组成，方法的恒温样品盘温度为27 ℃，He压力为80 kPa，向0.5 mL葡萄酒样品中加入活性碳、铜丝后，与0.3%CO2和He混合气平衡24～48 h，质谱仪测定同位素交换平衡后CO2中δ18O，用标准水样校正测定结果。

为验证方法的稳定性，本研究按照GB 6379.2《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》的有关规定，对本研究测定葡萄酒水中δ18O的稳定性进行对比分析，结果列于表3。

表3 葡萄酒水中δ18O的实验室协同实验Table 3 Repeatability and reproducibility of δ18O-value of water in wine

3 GasBench Ⅱ-IRMS 在葡萄酒掺水鉴别中的初步研究

为检验本方法在葡萄酒掺水鉴别中的应用效果，选择葡萄酒和蒸馏水为研究对象，并将葡萄酒与蒸馏水按照2∶8、4∶6、6∶4、8∶2比例进行配制，混匀，得到外源水掺入比例分别为0、20%、40%、60%、80%、100%的6个模拟样品，并测定其水中δ18O，结果示于图3a。各样品的水中δ18O随着外源水含量的增加而下降，且呈现良好的线性负相关关系(R2=0.998 8)，拟合方程为δ18O=-10.255x+1.028 3(x为外源水含量)。因此，针对该葡萄酒和外源水，可利用此关系检测葡萄酒中是否掺水，并可进一步推断外源水的含量。然而需要注意的是，拟合方程中的斜率与截距并非常数，会因原葡萄酒、外源水的水中δ18O不同而变化，结果示于图3b。

图3 葡萄酒水中δ18O与外源水含量的相关性分析Fig.3 Correlation between δ18O of water in spiked wine and exogenous water content

4 结论

本研究建立了GasBench II-IRMS测定葡萄酒水中氧同位素组成的在线分析方法，实验结果表明，反应瓶在52 h内不会出现同位素分馏，葡萄酒样品体积及乙醇均不会影响测定结果，平衡24 h后可达到交换平衡，在24～48 h内测定时的重复性与再现性结果均满足实验需求。相对于离线测定方法，该方法操作简便、分析速度快，适合葡萄酒行业和质检系统的大规模样品测定。

通过模拟实验表明，葡萄酒水中δ18O与外源水含量线性相关，可用于葡萄酒中外源水含量的判别。

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