尹 红,朱丰海,辛海量
(1.解放军总医院药品保障中心,北京 100853;2.上海警备区第五干休所门诊部,上海 200336;3.第二军医大学中医系,上海 200433)
刺五加又名五加参、刺拐棒,是五加科植物刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.)Harms]的根和根茎,在我国历代本草典籍中多有记述。《本草纲目》载刺五加“补中益气,坚筋骨,强意志,久服轻身耐老”。该药性温,味辛、微苦,无毒,入脾肾经;能扶正固本、补肾健脾、益智安神;主治脾肾阳虚,腰膝酸软,体虚乏力,失眠,多梦,食欲不振。近年来,国内外学者经过大量的实验,证实刺五加含有多种活性成分,如酚苷、多糖、氨基酸等[1,2]。药理作用研究表明,刺五加可增强机体非特异性防御能力,具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射损伤及抗疲劳等作用,可治疗神经衰弱、糖尿病和心脑血管疾病等[2],其对慢性疲劳综合征的作用是目前研究的热点之一。本研究观察刺五加根提取物[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.) Harms extract, ASE]的抗慢性疲劳(chronic fatigue,CF)作用及对CF大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴的影响,探讨其抗疲劳机制。
1.1 动物 将健康普通级雄性SD大鼠30只,体重(200±20) g[购自军事医学科学院实验动物中心,动物合格证号SCXK-(军)2010-081]。将大鼠分笼喂养,自由饮食,在室温23~28 ℃,湿度40%~70%的动物房中适应性饲养1周,照明时间随同自然变化。
1.2 药品和试剂 刺五加根提取物(ASE,AS204856),主要成分是刺五加苷B+E,为棕黄色粉末(宁波金艾农生物科技有限公司)。促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮质酮、促肾上腺皮质激素释放素(corticotropin releasing hormone,CRH)放射免疫试剂盒(上海市生物制品研究所放免室);M-MLV逆转录试剂盒(美国Promega公司)。PCR所需试剂和抗体(Biotech)信息见下文方法描述。其他试剂均为市售分析纯。
1.3 仪器 Bio-Rad MyIQ5实时(real time)PCR (RT-PCR)仪,WFZ UV-2800H紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司);1-15K型台式高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂)。
2.1 动物分组及给药 适应性饲养1周后,大鼠按照体重分层随机分为5组:对照组、CF组和ASE 50、100、200 mg/kg组, 每组6只。 5周适应性训练后开始给药, 分别灌胃给予生理盐水、 生理盐水和ASE 50、100、200 mg/kg,灌胃容积均为0.8 ml/kg。每天给药1次,共21 d。
2.2 CF大鼠模型的建立 除对照组6只大鼠外,其余24只大鼠均先于动物跑台上进行5周适应性训练:每天训练20 min,跑台的坡度为0度,跑速每周递增,依次为15、22、27、31、35 m/min,每周训练6 d。然后进行3 周的大强度耐力训练,每天训练35 min, 坡度为0,速度为35 m/min。训练共8周[3]。力竭判断标准为动物跟不上预定速度,大鼠臀部压在笼具后壁,后肢随转动皮带后拖达30 s,毛刷刺激驱赶无效,四肢无力支持住身体、头部低垂、电刺激后不能继续正常奔跑。行为特征为呼吸深急、幅度大、精神疲倦,俯卧位垂头,刺激后无反应。
2.3 取材 训练第8周末称大鼠体重并进行跑台力竭实验,分别记录各组跑至力竭的时间。实验结束时立即用乙醚轻度麻醉,眼眶取血6 ml,4 ℃静置30 min后,1.2×103×g离心15 min,分离上层血清。采血后迅速断头,鼠头放在冰盘上分离大鼠下丘脑,于液氮灌中速冻,并于-80 ℃冷藏备用。
2.4 检测方法
2.4.1 CRH、ACTH和皮质酮的血浓度的测定 应用放射免疫分析法测定,由北京福瑞生物工程公司协助测定。
2.4.2 RT-PCR检测促肾上腺皮质激素释放素受体1(corticotropin releasing hormone receptor 1,CRHR1) mRNA 取下丘脑组织放入1.5 ml的Eppendorf离心管内,加入300 μl的Trizol,按RNA抽提试剂盒说明书操作,提取组织总RNA备用(吸光度A260/280在1.8左右,表明RNA分子完整)。按M-MLV逆转录试剂盒说明书合成cDNA,并以cDNA为模板,采用荧光定量试剂盒SYBR Primer Script PCR Kit进行PCR反应,CRHR1和内参物还原磷甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物、产物大小、退火温度及循环数见表1。根据产物扩增曲线、CT值(表示每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)、 熔解曲线分析扩增效率, 优化反应条件, 最终确定为: 取1∶5稀释的cDNA 2 μl,加入2×SYBR Premix ExTaq 12.5 μl,上、下游引物各1 μl(终浓度10 μmol/L), 去离子水8.5 μl, 总反应体系 25 μl。RT-PCR反应条件,采用2复孔进行反应;预变性:95 ℃ 10 min,变性:95 ℃ 10 s,熔解温度(Tm) 40 s,共40 个循环;延伸:95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。从Tm到95 ℃每上升0.5 ℃取一次荧光值,最后生成熔解曲线,确定反应产物的单一性。图像定量分析软件进行数据处理,通过标准曲线得到与每个样本CT值对应的模板中目的基因的浓度,结果用目的基因与内参(GAPDH)的相对表达量表示。
表1 引物序列和实验条件
3.1 ASE对CF大鼠力竭时间的影响 用药后,CF组,ASE 50、100、200 mg/kg给药组大鼠运动的力竭时间依次为(72.2±1.72)、(77.4±4.92)、(84.0±4.86)、(96.4±3.61) min,与CF组比较,100、200 mg/kg ASE组大鼠的力竭时间明显延长,差异有显著意义(P<0.01)。说明ASE可有效延长CF大鼠的力竭时间,有明显的抗疲劳作用。
3.2 ASE对CF大鼠ACTH、CRH、皮质酮血清浓度和下丘脑CRHR1mRNA表达的影响 ASE对CF大鼠ACTH、CRH、皮质酮血清浓度和下丘脑CRHR1mRNA表达的影响见表2。由表2可见,与对照组相比,CF组大鼠血清ACTH、CRH和皮质酮的含量均有明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。ASE 50、100、200 mg/kg组大鼠血清ACTH、皮质酮、CRH含量与CF组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。
RT-PCR实验显示,CRHR1mRNA 引物扩增CT值为18.59~30.73,熔解曲线分析特异性产物Tm值为(52±1) ℃,标准曲线相关系数为0.998。GAPDH引物扩增CT值为13.28~24.88,熔解曲线分析特异性产物Tm值为(58±1) ℃,标准曲线相关系数0.999 4。从表2可见,CF组大鼠下丘脑CRHR1mRNA的相对表达量与对照组比较,有明显增加(P<0.01);ASE 50、100、200 mg/kg可有效抑制CF引起的CRHR1mRNA水平的升高(P<0.05,P<0.01)。
表2 刺五加提取液对慢性疲劳大鼠ACTH、CRH、皮质酮血清浓度和下丘脑CRHR1 mRNA表达的影响
Table 2 Effects of ASE on serum levels of ACTH, CRH, corticosterone and the expression of CRHR1 mRNA in chronic fatigue rats
表2 刺五加提取液对慢性疲劳大鼠ACTH、CRH、皮质酮血清浓度和下丘脑CRHR1 mRNA表达的影响
**P<0.01,与对照组比较;△P<0.05,△△P<0.01,与慢性疲劳组比较;ASE:刺五加提取液;ACTH:促肾上腺皮质激素;CRH:促肾上腺皮质激素释放素;CRHR1:促肾上腺皮质激素释放素受体1;GAPDH:还原磷甘油醛脱氢酶
组别ACTH(ρB/pg·ml-1)CRH(ρB/ng·ml-1)皮质酮(ρB/ng·ml-1)CRHR1mRNA/GAPDH对照组21.90±1.00 6.79±0.60 284.39±3.20 1.00±0.16慢性疲劳组30.49±2.20**14.16±1.17**370.10±21.39**1.80±0.56**刺五加提取液50mg/kg组22.74±1.12△△10.24±1.52 267.36±4.98△△1.65±0.27△刺五加提取液100mg/kg组17.76±1.02△△6.40±0.05△△248.45±1.31△△1.50±0.18△△刺五加提取液200mg/kg组18.67±0.89△△6.21±0.47△△291.58±5.03△△1.20±0.21△△
应激与慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome, CFS) 的发生是目前研究的热点,众多研究发现CF在CFS的发病中起了重要的作用[4]。精神应激,精神、心理压力,长期的脑力、体力劳动过度,负性生活事件,不良生活习惯等都可能使机体产生慢性应激反应,然后引起机体免疫系统和神经内分泌等多系统的功能紊乱,最终导致以疲劳为主要表现的多组织、器官功能紊乱的CFS相关症状。HPA轴是机体内分泌系统的重要调节通路,当有应激发生时,此信号通过神经的传导进入机体的大脑皮层和边缘系统,整合后的信号再传入到下丘脑,合成、分泌CRH;CRH再通过垂体门脉血流到达垂体,在这里与相应的受体结合,刺激垂体分泌ACTH;ACTH再经血液循环到达肾上腺,在肾上腺与相应的受体结合后刺激肾上腺皮质合成和分泌糖皮质激素[5]。在正常机体中,当ACTH和糖皮质激素升高时,可反馈抑制CRH和ACTH的分泌,但在发生应激时,上述反馈抑制作用大大减弱,从而出现ACTH和皮质酮的分泌高峰,导致HPA轴功能的亢进。若应激持续存在,则可以出现下丘脑、垂体、肾上腺的重量改变及其功能的异常[6]。大多数的CFS病人在发病前存在长期的体力或情感的应激,这种应激状态引起HPA轴功能的亢进,使得糖皮质激素和其他激素释放增加,这些激素量的增加会改变机体多系统的功能状态,进而影响行为方式,最终出现疲劳、焦虑、记忆力减退等CFS的临床症状[7,8]。
ASE明显延长了大鼠跑台运动时间,延缓了大鼠运动性疲劳的发生。这一结果可能与ASE含有多种活性成分有关,可降低血清CRH、ACTH、皮质酮的激素水平,从而抑制了大强度运动造成大鼠体内激素分解代谢持续增加,抑制了HPA轴亢奋有关。为了进一步阐明ASE对HPA轴的调节作用,作者还测定了其对下丘脑CRHR1mRNA表达的影响。结果显示,ASE调节抑制CF大鼠HPA功能亢进,可能与其下调CRHR1mRNA的表达,从而调节了与CRHR1偶联的信号通路有关。本研究为进一步探索ASE抗慢性应激疲劳的下丘脑上行调控机制研究奠定了基础,对运动能力的提高有重要意义,也为刺五加防治现代流行疾病提供了实验依据。
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