闽东地区畲族人群CYP2C19基因多态性分析

林妙春，郑建明，叶晓峰，游平弟,郑长业，洪永强

(福建省宁德市闽东医院中心实验室，福安 355000)

氯吡格雷、阿司匹林用于缺血性心脑血管疾病的二级预防病人时，常发生氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance)[1]和阿司匹林抵抗(aspirin resistance)[2]现象，表现出较大的个体差异。其原因主要为代谢过程中所依赖的酶的个体差异，即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。氯吡格雷活化所依赖的CYP450酶存在遗传多态性[3]，CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因突变可导致氯吡格雷活性代谢产物生成减少，抗血小板作用减弱，造成血小板聚集。不同种族人群CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因突变的发生率不同。福建省福安市是畲族人口分布最多、最集中的地区。至今，闽东地区畲族人群CYP2C19基因多态性分布情况尚不清楚。本研究采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术分析该人群CYP2C19基因多态性的分布，为进行个体化用药提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 标本、试剂和仪器 标本采集：按知情同意原则，在福安市畲族村采集3代以上属于畲族原住民的血液标本。研究时间为2011年10月至2013年3月。汉族健康人群血液标本为健康体检所抽取的外周血，由福建省宁德市闽东医院检验科提供。

血液基因组DNA提取试剂盒(美国Sigma公司)，琼脂糖(上海生工公司)，PCR引物由上海生工公司合成并经HPLC纯化。PCR试剂盒、Sma Ⅰ内切酶、BamH Ⅰ内切酶、DNA低分子量对照品(加拿大Fermentas公司生产，厦门鹭隆生物科技发展有限公司经销)。5332型PCR仪、5810R型低温离心机、移液器(德国Eppendorf公司)；UV-1800PC紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；JS-350型多功能水平电泳槽，JS-680B型凝胶成像图像分析仪(上海培清科技有限公司)。

1.2 DNA提取 按血液基因组DNA提取试剂盒使用说明书步骤操作，取含EDTA的抗凝血300 μl，进行基因组DNA的提取。提取的DNA用紫外分光光度计测定吸光度(A)并计算浓度及纯度，DNA浓度(μg/μl)=A260×50×稀释倍数/1000，DNA纯度=A260/A280。DNA于-20 ℃保存。

1.3 PCRCYP2C19*2的引物分别是Forward:5′-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3′ 和Reverse:5′-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3′；CYP2C19*3的引物分别是Forward: 5′-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3′和Reverse:5′-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3′[4]。PCR扩增体系为25 μl，包含12.5 μl PCR混合缓冲液，1 μl DNA模版，1 μl 10 μmol/L的上游引物和下游引物。PCR反应程序：(1) 94 ℃ 预变性5 min；(2)94 ℃变性1 min，57 ℃(CYP2C19*2)和54 ℃(CYP2C19*3)复性1 min，72 ℃延长1 min，37个循环；(3)72 ℃延伸10 min。该扩增程序在PCR仪上完成。

1.4 基因分型 采用PCR-RFLP进行基因分型。CYP2C19*2和CYP2C19*3的PCR产物分别用Sma Ⅰ内切酶和BamH Ⅰ内切酶在37 ℃酶切1 h，酶切产物用3% 的琼脂糖凝胶电泳显示条带。

1.5 统计学处理 基因型分布频率采用统计软件SPSS16.0进行χ2检验，Hardy-Weinberg遗传平衡定律验证。等位基因频率=等位基因出现的数目/总基因数×100%。

2 结 果

2.1CYP2C19各基因型电泳结果CYP2C19*2的Sma Ⅰ内切酶酶切位点突变，DNA片段不能被切割，显示为169 bp的单一片段，基因型表示为CYP2C19*2/*2(如图1中2、3条带)；若酶切位点只有一侧位点突变，酶切产物则显示49 bp、120 bp、169 bp 3个片段，基因型表示为CYP2C19*1/*2(如图1中5、6条带)；野生型CYP2C19*1酶切位点未突变，DNA片段切割为49 bp和120 bp 2个片段，基因型表示为CYP2C19*1/*1(如图1中条带4)。CYP2C19*3的BamH Ⅰ内切酶酶切位点突变，DNA片段不能被切割，显示为329 bp的单一片段，基因型表示为CYP2C19*3/*3(如图2中1、2条带)；若酶切位点只有一侧位点突变，酶切产物则显示96 bp、233 bp、329 bp 3个片段，基因型表示为CYP2C19*1/*3(如图2中条带3)；野生型CYP2C19*1酶切位点未突变，DNA片段切割为96 bp和233 bp 2个片段，基因型表示为CYP2C19*1/*1(如图2中条带4)。

图1 CYP2C19*2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图(Sma Ⅰ 酶切)

图2 CYP2C19*3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图(BamH Ⅰ酶切)

2.2CYP2C19各种基因型和等位基因 汉族和畲族人群CYP2C19各种基因型和等位基因频率分布见表1、表2。经χ2检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明这两个基因的变异被闽东地区汉族和畲族人群所获得，且变异率可维持在相应的水平上。由表1可见，汉族人群中有21.4%存在CYP2C19*2突变纯合体，高于畲族人群(9.4%)，差异显著(P<0.05)；而两个民族CYP2C19*3突变纯合体的频率相当，分别为2.9%和2.2%，无显著差异。汉族与畲族CYP2C19*2突变杂合体的频率分别为28.6%和30.0%，CYP2C19*3突变杂合体的频率分别为11.4%和16.7%。由表2可见，汉族CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因频率均显著高于畲族人群(P<0.05)。

表1 汉族和畲族人群CYP2C19基因型频率

表2 汉族和畲族人群CYP2C19等位基因频率

3 讨 论

CYP是一类亚铁血红蛋白-硫醇盐蛋白的超家族，是由一组结构和功能相关的超基因家族编码的同工酶，主要存在于肝细胞微粒体与线粒体内膜上，是一种末端加氧酶，参与生物体内多种药物代谢。CYP450酶系最主要的三个家族是CYP1、CYP2和CYP3，其中最重要的7种是：CYP1A2、2A6、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4。CYP450参与许多内源性物质,如维生素D3、前列腺素、脂肪酸，及许多外源性物质，如药物、毒物的代谢。

对于缺血性心脑血管疾病，通常采用氯吡格雷、阿司匹林等进行二级预防，临床上已证实氯吡格雷抗血小板效果比阿司匹林好，但是价格较高。氯吡格雷作为一种新型噻吩并吡啶类衍生物，是一种前体药物，需通过氧化作用转化成2-氧基-氯吡格雷，然后再经过水解形成活性代谢物(一种硫醇衍生物)，这一活性转化主要依赖于肝脏CYP450酶作用。该活性代谢物通过选择性地与血小板表面腺苷酸环化酶偶联的二磷酸腺苷(ADP)受体P2Y12结合，选择性地抑制由ADP诱导的血小板聚集，同时氯吡格雷还可以阻断血小板激活后级联放大效应，抑制非ADP诱导的血小板聚集。然而，氯吡格雷活化所依赖的CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因的突变会导致抗血小板药物的代谢减弱[5]。美国FDA强调CYP2C19*2及*3基因的重要性，并强调在该等位基因突变率极高的人群中使用氯吡格雷治疗时应慎重[6]。本研究选用CYP2C19*2及*3作为研究对象，主要是因为这两个等位基因突变在东方人中较为常见。CYP2C19*2代谢能力减弱主要表现在CYP2C19 cDNA外显子5的681位点碱基G突变为A，最终导致无功能蛋白酶的合成。CYP2C19*3的弱代谢则主要表现在CYP2C19 cDNA外显子4的636碱基G突变为A，导致蛋白质合成提早终止。根据这两个等位基因突变导致的代谢效率变化，可将个体分为弱代谢者 (poor metabolizers，PM)、中等代谢者 (intermediate metabolizers，IM)、广泛代谢者 (extensive metabolizers，EM)以及超速代谢者 (ultra rapid metabolizers，UM)4种类型。研究数据显示，亚洲人群(包括日本、菲律宾及中国)CYP2C19*2及*3等位基因发生率均高于欧美及非洲国家人群[7,8]。而国内各民族(包括汉族、傣族、白族、苗族、侗族等)CYP2C19*2及*3等位基因发生率亦存在差异[9]。

本研究首次测定了闽东地区畲族与汉族人群等位基因CYP2C19*2及*3的发生频率，结果表明，畲族人群两个等位基因发生频率均低于汉族，且差异显著。该结果与闫春兰等[10]得到的结果不一致，浙江省畲族人群的CYP2C19*2发生频率高于汉族(32.5%vs28%)。浙江省的畲族研究样本来源于学生，大多数年龄较小。而本研究样本年龄段在19～81岁，为原住民，在饮食方面更加偏向高盐的传统食物，且吸烟者比例较学生群体高。因此，推测年龄、饮食以及是否吸烟的差异是造成两个研究结果不同的原因，有待更深入的研究。另有魏伟等[11]的研究指出，福建省汉族人群的CYP2C19*2和CYP2C19*3的发生频率分别为32.4%和5.8%，低于本研究的结果。该研究样本来源于福州地区健康体检人员，而本研究汉族人群为福安地区健康体检人员。地域、饮食等差异可能是造成结果不同的原因。

本研究结果表明，福建省福安地区畲族人群中弱代谢者比例较汉族低，因此可以预测畲族人群出血性脑卒中的治疗使用氯吡格雷效果更佳。同一种族在不同地区基因型和等位基因频率也有所差异，实施个体化治疗的同时还应该考虑地区因素。有研究表明，影响CYP2C19酶活性的因素除了基因型的不同外，还有性别、口服避孕药、吸烟等[12]，因此临床用药时还需综合考量各项因素。

总之，CYP2C19等位基因突变率在不同民族、不同地区之间存在差异性。本研究结果为临床个体化用药提供了参考依据。课题组今后将在药物代谢与基因多态性关系上做进一步研究，以促进临床上个体化治疗。

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