用HPLC法同时测定蜘蛛香中4种缬草素类成分的含量

王素娟，郑承剑，岳 伟，龚颖珍，秦路平*

(1.宁夏医科大学药学院,银川 750004;2.第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)

蜘蛛香药材为败酱科缬草属植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根茎和根，具有疏散风热、利咽、透疹、明目退翳、解痉等功效，主要用于治疗风热感冒、眼痛音哑、麻疹不透、风疹瘙痒、目赤翳障、惊风抽搐和破伤风[1]。药理学研究表明，蜘蛛香还具有抗焦虑和抗氧化等药理作用[2，3]。蜘蛛香药材中起镇静、安神作用的主要活性成分为缬草素类化合物[4]，包括缬草三酯、乙酰缬草三酯和二氢缬草三酯等。《中华人民共和国药典》2010年版一部收载了蜘蛛香，规定该药材按干燥品计算缬草三酯和乙酰缬草三酯总含量必须≥0.80%[1]。有文献报道用HPLC法测定蜘蛛香中缬草三酯、乙酰缬草三酯及其分解产物 baldrinal的含量[5]。本研究建立了HPLC法，测定四川、云南、贵州三省所产蜘蛛香药材中4种含量较高的缬草素类化合物(缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P、Jatamanvaltrate Q)的含量，以进一步完善蜘蛛香药材的质量控制标准。

1 仪器和试药

1.1 仪器 1200系列HPLC仪、二极管阵列检测器、Chemstation 10.2色谱工作站、Eclipse OB-C18色谱柱(美国安捷伦公司)；AL104电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；USC-702型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)。

1.2 试剂和药材 缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的对照品(第二军医大学药学院生药学教研室自制)，结构经UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR及2D NMR鉴定，用HPLC法检测含量>98%。甲醇、乙腈(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为重蒸馏水(第二军医大学药学院自制)。蜘蛛香药材购自安徽省亳州市药材市场和成都国际商贸城荷花池中药材专业市场,产地分别为贵州省贵阳市、云南省师宗县、四川省成都市，均经第二军医大学药学院生药学教研室秦路平教授鉴定为蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根茎和根。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Eclipse OB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，0～20 min A∶B=75∶25，20～25 min A∶B=87∶13,25 min以后A∶B=75∶25；流速0.8 ml/min；柱温25 ℃；检测波长256 nm；进样量20 μl。

2.2 溶液的配制 (1)对照品溶液：取干燥至恒重的缬草三酯、Chlorovaltrate[6]、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q[7]对照品适量，精密称定，置10 ml量瓶中，加适量甲醇溶解，再加甲醇至刻度，摇匀，得到缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q浓度分别为0.09、0.10、0.06、0.05 mg/ml的混合对照品溶液。(2)供试品溶液：取蜘蛛香药材(编号GZ07)2.0 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，称定质量。在超声仪中超声提取30 min，取出，放冷，再称定质量，以甲醇补足损失的质量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。(3)阴性对照溶液：以甲醇作为阴性对照溶液。

2.3 系统适应性实验 取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按2.1项色谱条件分别进样测定，得到色谱图见图1。由图1可见，4种缬草素类化合物分离良好，基质对主药峰无干扰。与对照品溶液和供试品溶液色谱图相比，阴性对照溶液的基线呈斜线，考虑可能是由于缬草素类化合物的存在增大了溶液的黏性，从而使基线有所不同。

图1 蜘蛛香的HPLC谱图

2.4 线性关系的考察 取2.2项的混合对照品溶液2、6、10、14、18、22、26 μl分别进样测定，以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程，见表1。

2.5 精密度实验 取2.2项的混合对照品溶液，平行测定7次，计算RSD。结果缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的RSD分别为1.31%、1.41%、2.82%和1.35%(n=7)。

2.6 重现性实验 取蜘蛛香药材粉末(编号GZ07)，精密称取4份，每份2.0 g，按2.2项下(2)方法制备供试品溶液，进样20 μl，测定缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的峰面积，计算RSD。结果上述4种成分的RSD分别为2.08%、1.43%、1.86%和1.39%(n=4)。

表1 4种缬草素类化合物的线性回归方程

2.7 加样回收率实验 精密称取蜘蛛香药材粉末5份(编号GZ07)，每份2.0 g，分别加入2.2项的混合对照品溶液1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μl，然后按2.2项(2)方法制备供试品溶液，进样测定。结果测得缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的平均加样回收率分别为(99.72±0.33)%、(97.74±1.05)%、(99.90±0.77)%和(100.03±1.47)%(n=5)。

2.8 稳定性实验 取室温储存的供试品溶液(编号GZ07)，分别于配制后0、4、8、12、16、24 h测定峰面积，计算RSD。结果缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的RSD分别为2.78%、1.98%、2.21%和2.62%(n=3)，表明供试品溶液室温储存24 h基本稳定。

2.9 样品含量测定 将云南、四川、贵州三省所产蜘蛛香药材按2.2项(2)方法制备供试品溶液，分别进样测定，以峰面积按外标法计算含量，结果见表2。

表2 蜘蛛香中4种缬草素类成分含量测定结果

Table 2 The results of content determination of 4 valepotriate compounds in Valeriana jatamansi Jones

表2 蜘蛛香中4种缬草素类成分含量测定结果

产地编号缬草三酯Chlorovaltrate Jatamanvaltrate P Jatamanvaltrate Q贵州GZ01 0．764 8±0．000 2 0．099 5±0．000 5 0．018 0±0．004 0 0．143 5±0．000 9贵州GZ04 0．043 4±0．000 4 0．082 0±0．000 4 0．019 7±0．000 5 0．075 8±0．000 1贵州GZ05 6．469 0±0．000 7 0．152 8±0．000 2 0．012 3±0．000 3 0．105 8±0．000 3贵州GZ07 0．882 8±0．000 8 0．212 0±0．000 2 0．063 8±0．000 3 0．710 0±0．000 5云南YN02 3．999 5±0．000 5 0．114 8±0．000 3 0．021 3±0．000 4 0．142 0±0．000 1云南YN03 0．553 0±0．000 1 0．137 0±0．000 6 0．105 5±0．000 5 0．749 5±0．000 8四川SC06 0．553 0±0．000 4 0．097 8±0．000 2 0．016 8±0．000 5 0．146 0±0．000 2

3 讨 论

本研究对供试品溶液的制备条件进行了考察，分别以加热回流、超声提取、渗漉方式提取蜘蛛香药材中4种缬草素类化合物。由于蜘蛛香药材中所含主要活性成分为环烯醚萜类化合物，高温加热可使其分解；渗漉提取所需时间较长；考虑超声提取耗时短，提取率高，故采用超声提取法。作者考察了以甲醇-水和乙腈-水系统作为流动相的色谱行为，甲醇-水系统对缬草三酯和Chlorovaltrate的分离度较差，而乙腈-水系统的分离度较好，故选用乙腈-水系统作为流动相，并经实验确定采用梯度洗脱法分离效果较好。有文献报道用HPLC法测定蜘蛛香药材中缬草三酯、乙酰缬草三酯及其分解产物 baldrinal的含量[5]，但并无文献报道同时测定缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q此4种缬草素类化合物的方法。本研究首次采用HPLC法同时测定了蜘蛛香药材中缬草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的含量，4种成分基线分离良好，精密度、准确度和稳定性符合要求，可用于蜘蛛香药材的质量控制。

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