核转录因子、c MY C在弥漫大B细胞淋巴瘤亚型中的表达及意义

肖建波 刘卫东 李海丽 王轶楠 马守东 赵 郁 王钧 刘金慧

河北省唐山市人民医院放化疗科，河北 唐山 063000

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphomas，DLBCL）是非霍奇金淋巴 瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）中最常见的一种亚型，占NHL的30%～40%，是一种异质性很强的疾病，在临床表现、组织形态和预后等多方面都具有很大差异。因此Alizadeh等[1]根据基因表达谱不同，将DLBCL分为生发中心型（germinal center B-cell-like，GCB）和活化 B 细胞型（activated B-cell-like，ABC）。 但由于受技术条件的限制，基因芯片技术尚无法在临床中普遍应用。2004年Hans等[2]应用免疫组化的方法，通过检测淋巴瘤组织中CD10、BCL6和MUM1的表达情况进行分型，分为生发中心型（GCB）和非生发中心型（non-GCB，ABC）两个亚型。该免疫组化分型与基因芯片的分型结果具有较高的符合率，其中GCB型为71%，非GCB型为88%。在2008年WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案中，建议可用免疫组化方法对DLBCL进行分型。近年研究发现，DLBCL的两种亚型在预后上有很大差别，这与两种亚型的细胞遗传学不同有关，临床表现在蛋白表达不同。其中核转录因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB） 及原癌基因 cMYC 在 DLBCL 淋巴瘤的发生发展中起重要作用，本研究拟探讨NF-κB p65、cMYC在DLBCL不同亚型之间的表达情况及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 收集57例唐山市人民院2008年1月～2012年5月收治的DLBCL患者淋巴结组织蜡块，全部重新复查淋巴结蜡块材料良好，同时上述患者均经HE及免疫组织化方法确诊。通过免疫组织化学方法检测CD10、BCL6和MUM1表达情况，若 CD10和（或）BCL6（+）判定为 GCB 型，若 MUM1（+）判定为ABC型。

1.1.2 病历资料 57例患者中，男29例，女28例，年龄 17～72 岁，平均年龄（45±6）岁；国际预后指数（intemational pmgnostic index，IPI）评分 0～2 分 31 例，3～5分26例；临床分期Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期34例；GCB型24例，ABC型33例。本组病例随访时间8～42 个月，平均（23±2）个月。

1.2 免疫组化方法及阳性结果判定

患者淋巴结组织蜡块标本经10%中性福尔马林溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片，切片常规脱蜡水化；0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，10%小牛血清封闭切片，滴加一抗，4℃过夜。PBS洗后滴加广谱生物素化二抗（1∶200），SP 复合物（1∶200），DAB显色，苏木精复染胞核，脱水，透明，封片。分别设相应的阳性、阴性、空白对照。NF-κB p65及cMYC的主要阳性染色部位在细胞核和细胞浆。NF-κB p65及cMYC阳性表达为棕黄色或棕褐色细小颗粒。用已知阳性片为阳性对照，所有病理标本切片用PBS液代替一抗作阴性对照。阳性反应为细胞浆内或细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒。阳性反应为细胞浆内或细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒，阳性反应细胞>10%为阳性结果。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log Rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB p65、cMYC在 DLBCL组织中的蛋白表达情况

57例 DLBCL患者中 34例表达 NF-κB p65占59.6%。24例GCB亚型中，10例表达NF-κB p65占41.7%。33例ABC亚型，24例表达NF-κB p65占分别为72.7%。NF-κB p65在ABC亚型中的表达明显高于 GCB亚型，差异有统计学意义（χ2=5.569，P=0.029）。31例表达cMYC占54.4%。24例GCB亚型中，9例表达 cMYC占 37.5%，33例 ABC亚型，22例表达了cMYC占66.7%。cMYC在ABC亚型中的表达明显高于 GCB 亚型，差异有统计学意义（χ2=4.765，P=0.035）。见表1。

表1 NF-κB p65、cMYC阳性表达与临床特征的关系（例）

2.2 NF-κB p65、cMYC在 DLBCL组织中的蛋白表达与临床特征的关系

57例DLBCL组织NF-κB p65的表达在不同年龄（≤60 岁、>60 岁）、性别（男、女）、分期（Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期）及不同乳酸脱氢酶（LDH）（正常、升高）组间表达差异无统计学意义（P>0.05）。NF-κB p65在IPI 0～2分组阳性表达率为41.94%，3～5分组阳性表达率为 80.77%，表达差异有统计学意义（χ2=8.860，P=0.003）；NF-κB p65在ABC及GCB亚型组织中的阳性表达率分别为72.7%、41.6%，差异有统计学意义（χ2=5.569，P=0.029）。IPI是影响DLBCL预后的独立危险因素，ABC及GCB两种亚型淋巴瘤预后不同，而NF-κB p65在不同IPI及病理亚型组间表达均不同，提示NF-κB p65很可能与预后有关。cMYC的表达在不同年龄（≤60 岁、>60 岁）、性别（男、女）、分期（Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期）、LDH（正常、升高）及IPI组间表达差异无统计学意义。在ABC及GCBL亚型组织中的阳性表达率分别为66.7%、54.4%，差异有统计学意义（χ2=4.765，P=0.035）。两种病理亚型预后不同，进而推测cMYC的表达很可能与预后相关。见表1。

2.3 Kaplan-Meier生存分析

全部 DLBCL及 GCB亚型患者，NF-κB p65和（或）cMYC的阳性/阴性表达，患者的生存曲线差异无统计学意义（P>0.05），提示 NF-κB p65及 cMYC 的表达与DLBCL及GCB亚型患者生存不相关。在ABC亚型中，NF-κB p65阳性表达组生存率低于阴性表达组（P=0.043）（图1）。cMYC阳性表达组生存率低于阴性表达组（P=0.024）（图 2）。 提示 NF-κB p65 或cMYC的蛋白表达可能是影响ABC亚型预后的重要不利因素。

图1 33例ABC亚型患者NF-κB p65+/-表达组的生存曲线

3 讨论

DLBCL是常见的NHL之一，尽管美罗华为基础的化疗方案在DLBCL中取得了很大成功，然而高危患者的预后仍然较差，尤其是在ABC亚型治疗效果不佳。在临床工作中，识别特殊患者进行规范的分层治疗，成为一个亟待解决的问题。

目前，IPI是公认的DLBCL的独立不良预后因素，IPI为3～5分患者预后明显差于0～2分患者，许多学者提出以此进行分层治疗，最近有文献报道NF-κB与IPI同为DLBCL的独立不良预后因素，NF-κB阳性表达预后差[3]。NF-κB是广泛存在于真核生物细胞内的一种可诱导的转录因子家族蛋白，与淋巴瘤的发生、发展密切相关。董佑红等[4]报道DLBCL患者组织中NF-κB的表达与IPI评分相关，本研究也发现了NF-κB在DLBCL组织中表达，NF-κB p65的表达率为59.6%，并且高IPI评分组NF-κB p65阳性表达率高，与报道相似，近而推测 NF-κB表达很可能是影响DLBCL的一个不利因素。

图2 33例ABC亚型患者cMYC+/-表达组的生存曲线

研究发现NF-κB在DLBCL的不同亚型中，表达的临床意义不同，与ABC亚型预后不良有关[5]。Davis等[6]应用IκBα的特异性抑制剂阻断NF-κB通路后发现ABC亚型组的细胞出现快速的凋亡，而GCB亚型组细胞不受影响，提示NF-κB活化与ABC亚型DLBCL的增殖有关。孟伟等[7]报道NF-κB在ABC亚型中表达高于GCB型。NF-κB在ABC亚型DLBCL中的意义可能不同于GCB亚型。本研究NF-κB p65在ABC、GCB亚型组的表达率分别为 72.7%、41.6%，ABC亚型表达率明显高于GCB亚型。生存分析发现，在ABC亚型DLBCL中，NF-κB p65阳性与阴性表达组的生存曲线明显不同，阳性组生存率低于阴性表组，差异有统计学意义。但在GCB亚型中，本研究并未观察到类似现象，提示NF-κB p65很可能是ABC亚型DLBCL的不利预后因素。

MYC基因是位于8q24的原癌基因，对细胞增殖、生长、分化、凋亡及促进新生血管形成等方面发挥重要作用[8]。许多国内外研究表明cMYC基因异常与NHL的不良预后相关，MYC重排是独立于IPI的不良预后因子[6-9]。cMYC基因异常与DLBCL预后密切相关，可作为预测DLBCL的预后因素并指导治疗[9]。MYC基因重排是Burkitt淋巴瘤的特征，也发生在5%～10%的DLBCL患者中。近年来发现DLBCL患者的一个重要的危险因素是MYC易位，特别是它与BCL-2易位相连接时，预后极差。Johnson等[10]和Shimin等[11]研究发现，MYC蛋白在DLBCL的两种亚型中均有表达，当它与BCL-2共同表达时预后不佳，对标准的R-CHOP方案治疗效果差，MYC蛋白的高表达与易位相关。在DLBCL患者中，常有cMYC蛋白过表达的现象，Mossafa等[12]发现DLBCL患者中出现cMYC基因扩增，并且这些患者的预后较差。本研究也发现了cMYC在DLBCL中的表达，在ABC及GCB亚型中的表达率分别为66.7%、54.4%，差异有统计学意义。生存分析显示，在ABC亚型DLBCL中，cMYC表达阳性组与阴性组的生存曲线明显不同，阳性组生存率低于阴性组，差异有统计学意义。但在全部DLBCL及GCB亚型组并未观察到类似现象。MYC的负性预后作用在与BCL-2共表达患者中明显[10]，MYC基因扩增与BCL-2基因扩增正相关，均为ABC型显著高于GCB型[13]，BCL-2是 NF-κB的重要靶基因，在 ABC亚型中，常伴随NF-κB、BCL-2的过表达，由此推测在ABC亚型，cMYC的负性预后作用可能与 NF-κB、BCL-2的表达有关，但仍需进一步研究证实。

本研究发现，NF-κB p65和cMYC在ABC亚型的表达率均高于GCB亚型，在ABC亚型，它们的阳性表达均与预后差相关，它们的临床意义有相似之处。既往研究发现ABC亚型DLBCL，许多基因上调，如MYC、BCL-2、cyclinD2 等，Lim 等[14]研究发现这些基因的上调可能与NF-κB在ABC亚型中不断激活有关。由此本研究推测NF-κB p65和cMYC可能在ABC亚型的发生、发展过程中存在一定联系，但其机制仍不清楚，需待进一步研究探讨。在ABC亚型，NF-κB p65、cMYC的表达与生存密切相关，有可能成为ABC亚型新的预后指标，需在临床工作中进一步研究证实。

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