对虾白斑综合征病毒结构蛋白基因vp 95表达时序分析及其抗体的制备

高美玲，徐丽美，李 钫，杨 丰＊

（1.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门361102；2.国家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门361005）

对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是引起对虾爆发流行病的病原体［1］，该病发病快、传播速度快、致病能力强.感染该病毒的养殖场3～10d内达到100%死亡率［1－4］，给虾类养殖业带来巨大的经济损失，目前已成为虾养殖产业中危害最大的病原.WSSV是线形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus）的唯一成员.病毒粒子形态呈杆状型，大小约（250～380）nm×（70～150）nm，最外层是由2层单位膜组成的囊膜，紧接囊膜向内的是核衣壳.该病毒的基因组为双链环状DNA，大小约300kb，目前共测序完成3株病毒的全基因组序列［5－7］.

在WSSV基因组测序的基础上，利用蛋白质质谱技术对WSSV病毒粒子的结构蛋白进行分析鉴定，共鉴定42个结构蛋白［8－9］.经鉴定蛋白VP95不仅存在于膜蛋白，核衣壳蛋白中也有它的分布［8］，Tsai等［10］提出病毒粒子除了有核衣壳和囊膜外，在核衣壳和囊膜之间还有第3种结构称为外被（tegument），因此一些蛋白就被归类为外被蛋白，其中就包括蛋白VP95.这些研究结果表明，VP95是一种很重要的结构蛋白，可能对于病毒的包装起着极其重要的作用.为了深入研究蛋白VP95的功能，以及它在病毒粒子中的定位，本研究通过逆转录PCR的方法确定基因vp95的转录时间，确定其为晚期基因.其次尝试制备能够用于VP95蛋白检测，蛋白质定位等研究的专一性抗体，为该结构蛋白后续研究奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材 料

本实验所用淡水克氏原螯虾（Procambarus clakia）购于厦门市第八市场；TRL REAGENT为Mrcgene公司产品；逆转录试剂盒为Roch公司产品；菌株大肠杆菌（Escherichiacoli）XL1－Blue和BL－21（DE3）由本实验室保存；质粒pMD18－T Vector、T4 DNA ligase、限 制 性 内 切 酶、RNase－free DNase I、RNase inhibitor、Oligo（dT）引物均为TaKaRa公司产品；pET－His购于美国基因动力实验室有限公司；Ni2＋－NTA agaros购于Qiagen公司；20×TBST缓冲液购自上海生工生物工程有限公司；HiTrap NHS－activated HP亲和层析纯化柱子为GE Healthcare公司产品；抗生素氨苄青霉素为山东鲁抗医药股份有限公司产品；蛋白胨、酵母膏、琼脂为英国Oxoid公司产品；小量提取质粒试剂盒购于OMEGA公司；引物合成由上海生工生物工程技术有限公司完成；测序由上海英潍捷基贸易有限公司完成；多克隆抗体由厦门大学医学院陈福课题组制备；鼠抗组氨酸IgG购自SIGMA公司；碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG购自Promega公司；其余试剂均为国产分析纯试剂.

1.2 方 法

1.2.1 WSSV病毒粒子的纯化及基因组的提取

WSSV病毒粒子的纯化和基因组的提取参考本实验室已发表的方法［5，11］.取100μL纯化的病毒粒子悬液，加入终质量浓度0.05mg／mL的 Triton X－100，10 000g离心10min，得到的沉淀样品为病毒核衣壳蛋白（nucleocapsid protein），上清样品为病毒囊膜蛋白（envelope protein）.

1.2.2 RT－PCR

克氏原螯虾感染WSSV后（肌肉注射108病毒粒子／只），不同时间点取样（0，2，4，6，8，12h）.步足肌肉总RNA的提取参照TRL REAGENT试剂盒说明，随后用逆转录酶以及Oligo（dT）引物逆转录得到cDNA，以cDNA作为模板，分别用ie1、vp28、vp95或β－actin的特异性引物对（表1）进行PCR扩增.PCR产物经2%（质量分数，下同）琼脂糖凝胶电泳，并用紫外成像仪观察结果.

表1 RT－PCR分析引物序列Tab.1 Primer sets used for RT－PCR analysis

1.2.3vp95基因片段的克隆

基因vp95位于WSSV基因组中255 075～257 474nt，对应的ORF为 WSV442.经过生物学软件DNAstar分析该基因所编码蛋白的抗原性，选择其中间200个氨基酸进行克隆表达，分布在vp95基因的1 051～1 650nt.引物序列：5′－AGCggatccGAGCATCCTCTATCCCCTTCTATT－3′ （下 划 线 为BamH I 酶 切 位 点 ），5′－AGCaagcttTTCCAGTCTGACGACCCTGAC－3′（下划 线为HindIII酶切位点）；以纯化的 WSSV基因组作为模板，PCR程序如下：95℃变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；72℃延伸10min.PCR产物经BamH I和HindIII双酶切反应后，琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，然后将其连接至带有6个组氨酸标签的表达载体pET－His，并测序验证.

1.2.4 重组蛋白的表达纯化

将测序正确的质粒pET－His－VP95－M200转化至大肠杆菌BL－21（DE3），同时转化pET－His作为对照组.挑取单菌落分别转接至5mL含有100μg／mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养6h后，按照1∶200转接于200mL LB培养基（含100μg／mL氨苄青霉素）.培养至细菌生长对数中期（OD600值达到0.6）时，加入异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1mmol／L，20℃诱导表达24h.诱导前后分别取适量菌液进行SDS－PAGE分析.收集诱导后的大肠杆菌细胞，超声裂解细胞后，用特异性结合His标签的Ni2＋－NTA agaros纯化表达的重组蛋白.

1.2.5 多克隆抗体的制备及纯化

用纯化的重组蛋白His－VP95－M200免疫小鼠，免疫4周后眼球取血，去除血细胞得到血清.抗体纯化根据HiTrap NHS－activated HP纯化柱试剂盒的操作说明.首先，经 Ni2＋－NTA agaros纯化的抗原 His－VP95－M200 用 Coupling buffer （0.2mol／L NaHCO3，0.5mol／L NaCl，pH 8.3）稀释至终质量浓度1mg／mL，将抗原溶液注入HiTrap柱子，4℃吸附4h.分别用18mL Buffer A （0.5mol／L氨基乙醇，0.5mol／L NaCl，pH 8.3）和 18mL Buffer B（0.1 mol／L乙酸钠，0.5mol／L NaCl，pH 4）洗涤.然后，用Binding buffer（0.5mol／L NaCl，10mmol／L Tris－HCl4，pH 7.5）稀释多抗血清，经0.45μm的过滤器过滤后与抗原柱结合，再用5～10倍柱子体积的Binding buffer洗涤.最后，用2倍体积 Elution buffer（0.1 mol／L 甘氨酸，pH 2.5）洗脱，洗脱液立即用1mol／LTris－HCl pH 8.0调节pH至中性.

1.2.6 SDS－PAGE和 Western blot分析

重组表达的蛋白样品和病毒组分的蛋白样品按4∶1比例加入5×SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸10 min，冷却至室温后进行SDS－PAGE分离，经考马斯亮蓝染色、脱色后，观察分析结果.

对于Western blot分析，SDS－PAGE后不进行考马斯亮蓝染色，用半干式电转移法将蛋白转移至PVDF膜上，在含有5%（质量分数）脱脂奶粉的TBST中室温封闭1h，加入抗目标蛋白的鼠抗抗体（1∶5 000稀释）或者制备的抗血清，室温温育1h.在TBST漂洗3次后，PVDF膜与稀释在封闭液中的碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG（1∶10 000）温育1h，TBST漂洗3次，在NBT／BCIP显色液中.待出现清晰条带后，将膜转移至蒸馏水中终止反应即可.

2 结 果

2.1 基因vp95的表达时序分析

通过收集克氏原螯虾感染WSSV后不同时间的腹足样品，用RT－PCR分析vp95的转录时间，同时还检测了已经被鉴定的极早期基因ie1［12］和晚期基因vp28.结果表明（图1），从4h开始vp95开始转录，6 h转录水平有些增加，直到12h一直维持在这个水平.极早期基因ie1在2h就开始转录，并且之后一直保持同一转录水平.而vp28也是从4h开始转录，6h后转录有所增加.基因vp28和vp95都编码病毒结构蛋白，且起始转录时间相同.因此，vp95也是一个晚期基因.

2.2 重组蛋白的克隆表达及纯化

通过DNAstar软件分析vp95基因所编码的蛋白，截取vp95基因中间编码200氨基酸的序列（1 051～1 650nt），该氨基酸片段亲水性强，不含有α螺旋，抗原性较好.以WSSV基因组为模板，设计引物，通过PCR扩增得到600bp的片段，扩增结果经1.2%的琼脂糖电泳分离，与预测600bp大小一致（图2）.此片段依次克隆到pMD18－T Vector和pET－His载体中，经双酶切鉴定（图2）后测序验证，成功构建质粒pETHis－VP95－M200.

将质粒 pET－His－VP95－M200转化至表达宿主BL－21，加入IPTG 20 ℃ 诱 导表达 重组蛋白.SDSPAGE分析显示，加入IPTG诱导后约在32ku的位置有明显的融合蛋白表达带（图3，泳道2），而未经IPTG诱导的全菌对应位置的样品无明显条带（图3，泳道1）.诱导后的细菌经超声波破裂后离心，用Ni2＋－NTA agaros纯化，获得纯化的 His－VP95－M200融合蛋白（图3，泳道3）.Western blot检测得到的是带有His标签的融合蛋白（图3，泳道4）.

图1 RT－PCR对vp95的表达时序分析Fig.1 Time course analysis of vp95 transcripts by RT－PCR

2.3 抗体的特异性分析

将WSSV的EP、NP和全病毒粒子（virion，V）样品经10%（质量分数）SDS－PAGE电泳分离（图4（a）），考马斯亮蓝染色后出现许多病毒结构蛋白的条带.为了测定制备的VP95抗体的专一性，将抗血清稀释不同浓度，以囊膜蛋白、核衣壳蛋白和全病毒粒子样品为底物，Western blot检测蛋白 VP95（图4（b）），发现仅VP95能呈现清晰条带，说明制备的VP95抗体特异性强.同时，制备感染了WSSV的克氏螯虾的造血组织（hematopoietic tissue，HT）的样品，用制备的抗体作为一抗，检测其中的蛋白VP95.结果显示抗体可以专一性的检测到组织中的VP95蛋白（图4（b））.

3 讨 论

对于双链DNA病毒而言，其基因组的表达呈时序性，可分为极早期（immediately early）、早期（early）、晚期（late）基因.WSSV基因的转录活性已经在对虾和淡水螯虾中有广泛的研究，许多基因的转录时序已经被确定，包括极早期基因19个（ie1、ie2、ie3［12］、wsv051、wsv083、wsv249［13］等），早期基因 5个（rr1、rr2、pk1、tk－tmk、dnapol）［4－17］，晚期基因6 个（vp664、vp28、vp26、vp24、vp19、vp15）［18］.本研究通过高剂量WSSV（每只含108个病毒数）感染克氏原螯虾，提取总RNA进行RT－PCR，发现在2h时极早期基因ie1开始转录，而在4h时vp95基因开始转录，与vp28基因开始转录的时间相同，说明vp95也是一个晚期基因.

图2 VP95－M200PCR产物（a）、重组质粒pMD18－T－VP95－M200（b）和pET－His－VP95－M200双酶切（c）鉴定电泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of the PCR products of VP95－M200（a），identification of recombinant plasmid pMD18－T－VP95－M200（b）and pET－His－VP95－M200（c）by restriction analysis

图3 重组蛋白的 His－VP95－M200 12%SDS－PAGE电泳及Western blot分析Fig.3 12%SDS－PAGE and Western blot analysis of the expressed product of His－VP95－M200

图4 抗体对VP95的检测分析Fig.4 Analysis of VP95using the prepared antiserum

结构蛋白VP95是WSSV的重要的结构蛋白之一，为了研究它的定位及其在病毒包装过程中的作用，曾经多次尝试克隆多个不同位置，不同片段大小的多肽，均为不溶性表达，免疫小鼠得到的多抗对于蛋白VP95的检测效果并不好，无法满足对自然状态下VP95蛋白的免疫金标定位实验，及其他该蛋白功能研究的要求.本研究首先通过生物学软件对该蛋白的性质进行分析，选择vp95基因的1 051～1 650nt，主要是由于这段序列编码的多肽的亲水性氨基酸较多，容易得到可溶性的表达.为获得可溶性表达产物，尝试不同程度的低温诱导，发现16和20℃均为可溶性表达，最终选用20℃作为诱导条件.选用pET－His载体本身包含编码6个His的序列，能表达出含有His融合标签的重组蛋白，有利于后期的纯化.介质Ni2＋－NTA agaros可用于纯化带有His融合标签的重组蛋白，该介质价格低廉，纯化效率高，通过调整吸附液和洗涤液中咪唑的浓度，可以得到较纯的重组蛋白.提高吸附液中咪唑的浓度可以减少对大肠杆菌中蛋白的非特异性吸附，但太高浓度也可能导致重组蛋白结合效率降低.利用该介质获得了高纯度和高浓度的重组蛋白.

将纯化的融合蛋白免疫小鼠，得到多抗血清.经Western blot检测，此血清对结构蛋白VP95有很高的效价，并且有很强的专一性，能满足多种实验需求，如 Western bloting、免疫荧光、免疫金标等.同时，Western blot也可以检测出感染了WSSV的组织中的VP95.但是，多抗血清中不仅含有针对抗原的抗体，同时还含有很多其他的抗体和酶类等.因此，选择HiTrap NHS－activated HP （GE Healthcare）亲和纯化柱子纯化多抗血清.该纯化柱首先与抗原非特异性的结合，并将抗原固定在柱子上，再将血清与结合了抗原的柱子孵育，让血清中针对该抗原的抗体与抗原结合.通过洗涤，将结合的抗体及杂质去除，最后，用洗脱缓冲液将抗体从柱子上洗脱下来，得到较纯的针对VP95蛋白的抗体.经Western blot检测，仍然有较高的效价，而且去除杂质的血清可以用于免疫金标和免疫荧光等实验，为进一步研究VP95蛋白的功能，及其在病毒粒子的定位提供了很好的条件.

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