谷氨酸棒杆菌生产L -赖氨酸的培养优化和产酸特性研究

苏会波，林海龙，罗 虎，周 勇，卢宗梅

（1.中粮营养健康研究院，国家能源生物液体燃料研发中心，国家能源生物炼制研发中心，北京 100020;2.中粮生物化学（安徽）股份有限公司，安徽蚌埠 233010）

L－赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一［1－4］。目前，L－赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种。2012年，国内的L－赖氨酸产能约为150万 t，产量约为100万t。2013年，国内的L－赖氨酸产能增至约230万t，生产厂家有16家以上，以大成生化、宁夏伊品、中粮生化和希杰等企业为主［5］。L－赖氨酸约90%用作饲料工业中的营养强化剂，10%用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体［6－9］。

目前，L－赖氨酸的研究主要集中在选育高产菌株、开发新生产工艺和优化原发酵工艺等方面。张伟国等［10］将黄色短杆菌进行诱变得到高产菌株，摇瓶发酵72h后L－赖氨酸浓度可达77～82g/L。廉少杰等［11］通过发酵温度优化，将L－赖氨酸发酵浓度从111g/L提高到151g/L。周勇等［12］对L－赖氨酸发酵培养基成分进行优化，在7L发酵罐中发酵64h后，L－赖氨酸盐酸盐浓度可达161g/L，糖酸转化率可达58.3%。在其他学者的研究中，很少对L－赖氨酸发酵培养基中的成分进行重要性分析和系统性优化。因此，作者在研究中利用谷氨酸棒杆菌进行摇瓶培养生产L－赖氨酸，通过响应面分析法和氮源优化，对发酵培养基中的成分进行了重要性分析排序和系统性优化，将L－赖氨酸浓度从 1.90g/100mL提高至2.25g/100mL［13］。为了考察优化培养基对连续发酵生产L－赖氨酸的影响，本文在5L发酵罐中对优化培养基和原始培养基连续发酵生产L－赖氨酸的菌种生长和产酸特性进行了实验研究和分析，以期能促进L－赖氨酸生产的工艺优化和效益提升。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷氨酸棒杆菌B253 上海工业微生物研究所;原始发酵培养基（g/L） 葡萄糖40、（NH4）2SO410、苏氨酸 0.2、蛋氨酸 0.1、谷氨酸 0.3、KCl 2.4、KH2PO41.2、糖蜜9.0mL、NaCl 1.6、MgSO41.8、FeCl20.8、MnSO41.0 和维生素 B 1.0;优化发酵培养基（g/L）［13］葡萄糖 40、（NH4）2SO410、苏氨酸 0.2、蛋氨酸 0.2、谷氨酸0.21、KCl 2.4、KH2PO41.2、糖蜜 15.7mL、NaCl 1.6、MgSO41.8、FeCl20.8、MnSO41.0 和维生素 B 1.0;发酵培养基用 6% 氨水将 pH 调至 6.3～6.4，121℃ 灭菌20min;以上试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

NBS Bioflo 115发酵罐 艾本德中国有限公司;SBA－40E生物传感分析仪检测 山东省科学院生物研究所;UV－1750紫外可见分光光度计 岛津企业管理（中国）有限公司;SW－CJ－1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;SX－700灭菌锅 日本Tomy Digital Biology公司;5418微量台式离心机 德国艾本德股份公司;PT－15便携式pH测定仪 赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子罐培养 种子培养在容积为2L的全自动发酵罐中进行，培养体积为500mL。先用pH缓冲液和饱和亚硫酸钠溶液校正pH电极和溶氧电极，然后接入菌种开始培养。培养温度为37±0.5℃，流加25%浓度氨水控制培养 pH 为 6.8～7.0，搅拌速度为600r/min，通风量为 0.5L/min。培养周期约为 15～20h，菌种 OD 值（562nm，稀释 26 倍）为 0.8～1.0 时即可接入发酵罐。

1.2.2 发酵罐培养 发酵培养在容积为5L的全自动发酵罐中进行，先用pH缓冲液和饱和亚硫酸钠溶液校正pH电极和溶氧电极，然后接入200mL培养好的种子罐菌种液开始培养，培养温度为（37±0.5）℃，流加25%浓度氨水控制培养 pH 为6.8～7.0，搅拌速度为800r/min，通风量为2.0L/min。发酵罐培养过程中，主要控制参数为葡萄糖浓度、氨基氮浓度、pH和溶氧，每3h检测葡萄糖和氨氮浓度并调整流加速度。发酵罐培养周期控制在48h左右，发酵12h后每6h检测L－赖氨酸浓度。通过流加葡萄糖溶液和（NH4）2SO4溶液调整发酵溶液中还原糖浓度和氨基氮浓度，通过调整通风量和搅拌速度保证溶液中的溶氧充足。发酵罐中溶液液位随着流加溶液增多不断升高，当液位高于2500mL时开始排料，每次排出约100mL料液，装入封口三角瓶内于4℃冷藏，停罐时测量排料体积和L－赖氨酸含量。

1.3 分析方法

1.3.1 pH测定 PT－15便携式pH测定仪检测。

1.3.2 OD值测定 发酵液稀释26倍后，用 UV－1750紫外可见分光光度计检测562nm处吸光度。

1.3.3L－赖氨酸和还原糖测定 SBA－40E生物传感分析仪检测。

1.3.4 氨基氮测定 Dual Star氨氮测量仪检测。

1.3.5 总酸计算 总酸（g）=L－赖氨酸浓度（g/mL）×发酵液体积（mL）。

1.3.6 糖酸转化率计算 糖酸转化率（g酸/g糖）=产酸总量（g）/原料总糖（g）。

2 结果与讨论

2.1 菌种培养

接入种子罐的菌种液 OD值为 0.091，pH为6.89。接入种子罐后，种子罐发酵液的初始OD值为0.026，初始还原糖浓度为 3.9g/100mL，初始氨基氮浓度为0.345g/100mL，初始 pH 为6.33。发酵过程中通过流加50%浓度葡萄糖溶液确保还原糖浓度不低于0.3g/100mL。种子培养液中的菌种生长情况（OD值）、还原糖消耗和pH变化情况如图1所示。

图1 种子培养的OD值、还原糖消耗和pH变化Fig.1 OD、reducing sugar consumption and pH of seed culture

从图1可知，种子罐中的pH开始调整后，基本稳定在6.8～7.0。发酵开始到12h期间，菌种溶液 OD值从初始的0.026增加到0.224。还原糖消耗相对较少，仅从3.8g/100mL 降低到 3.3g/100mL。这是因为接种后菌种需要适应新的发酵环境，新陈代谢和自身生长缓慢，碳源消耗速度相对较低。发酵12h到15h期间，菌种处于快速生长时期，OD值迅速增加到0.549，同时消耗大量还原糖，还原糖浓度快速降低到1.6g/100mL。发酵16h 时，菌种溶液 OD 值为 0.815，满足发酵罐接种要求。此时，还原糖浓度为0.15g/100mL，利用率达96%，种子液中L－赖氨酸浓度为 1.86g/100mL。

种子罐中的氮源消耗如图2所示。从图2可知，种子液培养过程中氮源消耗较少，氨基氮仅从初始浓度 0.345g/100mL 下降到终点浓度 0.265g/100mL。这是因为初始培养基中含较丰富（NH4）2SO4，菌种培养刚刚进入对数生长期，未能大量消耗溶液中的氮源。另外，培养过程中因调节溶液pH需流加一定量的氨水，也可以作为氮源被利用。

2.2 发酵参数控制

图2 种子培养的氮源消耗Fig.2 Nitrogen source consumption of seed culture

谷氨酸棒杆菌连续发酵生产L－赖氨酸过程中，需要控制的主要参数为还原糖浓度、氨基氮浓度、发酵溶液的pH和溶氧。发酵溶液中的还原糖和氨基氮浓度变化如图3所示。发酵罐中接入菌种后，菌种逐步利用葡萄糖和（NH4）2SO4快速生长并产出L－赖氨酸。溶液的初始还原糖浓度为1.85g/100mL，发酵开始后还原糖浓度迅速降低，发酵12h后低于0.5g/100mL。发酵溶液中的葡萄糖作为碳源，主要影响微生物的能量代谢、菌体的生长和产物的合成，是至关重要的原料。发酵过程中通过流加50%浓度葡萄糖溶液将还原糖浓度维持在0.3～1.5g/100mL，以便能给菌种提供足够的能量和碳源。发酵溶液中初始氨基氮浓度为0.118g/100mL，发酵开始后逐步降低，发酵12h后低于0.05g/100mL。作为主要氮源，（NH4）2SO4可以为微生物提供丰富的氮元素，促进菌种的自身生长和代谢产酸，同时NH4+和S还可以激活L－赖氨酸合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶［14－15］。产酸过程中通过流加50%浓度（NH4）2SO4溶液将氨基氮浓度稳定在0.02～0.12g/100mL，以便能给菌种提供足够的氮源，但又不产生抑制作用。

图3 发酵溶液的还原糖和氨基氮控制Fig.3 Reducing sugar and amino nitrogen control in fermentation

发酵溶液中的pH、溶氧控制如图4所示。pH主要会影响微生物的新陈代谢及其对培养基成分的利用，从而影响微生物体内酶的活性和产物的代谢途径。发酵溶液的初始 pH 为6.3～6.6，发酵开始后逐步降低。赖氨酸发酵属于中性发酵，发酵过程中通过流加25%浓度氨水保持溶液pH稳定在6.8～7.0，以便谷氨酸棒杆菌能更好地生长和产酸。发酵溶液中的溶氧主要影响微生物的生长和能量代谢，同时会参与产物的合成。发酵溶液中初始溶氧为100%，发酵初期，菌种量少，虽然呼吸强度较大，但总体上需氧量不大，此时发酵液中的溶氧较高，发酵6h溶氧约为65%～75%。随着菌种大量繁殖进入对数生长期，发酵液的菌种浓度不断上升，需氧量也不断增加，使溶氧浓度明显下降，发酵18h下降至40%左右。而且菌种生长和产酸速度越快，溶氧消耗越快。对数生长期后，菌种的呼吸强度下降，需氧量减少，溶氧经过一段时间的平稳后开始回升，发酵结束后约为65%～85%。发酵过程中通过将通风量从1.0L/min提高到 2.0L/min，将搅拌速度从 400 转/min提高到600转/min，控制发酵溶液中的溶氧始终在40%以上，以给菌种提供充足的氧气用于新陈代谢和产物合成。

图4 发酵溶液的溶氧和pH控制Fig.4 DO and pH control in fermentation

2.3 菌种生长和产酸特性

发酵罐中的菌种生长如图5所示。谷氨酸棒杆菌在优化培养基和原始培养基中的生长趋势基本一致，接种后均很快进入对数生长期，在18h菌种量达到最大值，OD 值分别为 1.059和 1.232，对应的细胞干重达到8.0g/L和9.3g/L。菌种在此阶段处于旺盛生长时期，生长速率高于0.2g/L/h。发酵的前6h，菌种生长得最快，此时优化培养基和原始培养基中菌种的生长速率达到最高值，分别为0.53g/L/h和0.72g/L/h。发酵18h后，菌种新陈代谢进入稳定期和衰亡期，部分菌种发生自溶，发酵液整体生物量均有所降低。发酵48h到达终点时，优化培养基中菌种量为7.7g/L，比最高值降低了3.8%。原始培养基中菌种量为8.3g/L，比最高值降低了10.8%。值得一提的是，整个发酵过程中，优化培养基的菌种生长量和生长速率始终低于原始培养基。

图5 菌种生长曲线和生长速率Fig.5 Growth curve and rate of Corynebacterium glutamicum

谷氨酸棒杆菌的产酸特性如图6所示。从图6可以看出，整个发酵周期优化培养基的产酸速率和L－赖氨酸浓度增长趋势与原始培养基一致。接种后6～24h是菌种快速产酸时期，该阶段优化培养基和原始培养基中菌种的最大产酸速率分别达到0.75g/100mL/h 和 0.81g/100mL/h，溶液中L－赖氨酸浓度由初始的 0.26g/100mL分别快速增长到 15.2g/100mL和15.4g/100mL。这是由于菌种在0～18h处于对数生长期，菌种新陈代谢旺盛，菌种大量繁殖，经过短暂延滞作用后代谢产物L－赖氨酸的浓度也相应快速增长。接种后18～36h是菌种新陈代谢的稳定期，谷氨酸棒杆菌在此阶段不再生长，菌种量基本上保持稳定，L－赖氨酸生产速率缓慢降低但仍保持在0.2g/100mL/h以上，L－赖氨酸浓度随着积累逐步增加。接种36h后，菌种新陈代谢进入衰亡期，L－赖氨酸生产速率进一步降低。发酵48h到达终点时，优化培养基中的L－赖氨酸浓度为20.8g/100mL，比原始培养基中的19.6g/100mL提高了6.1%。

表1 产酸过程中的原料消耗、总酸产量和糖酸转化率Table 1 Material consumption，L－lysine yield and conversion ratio

图6 发酵产酸曲线和产酸速率Fig.6 Production curve and rate of L－lysine

2.4 产酸总量和糖酸转化率

发酵过程中的葡萄糖与（NH4）2SO4消耗情况、产酸总量和糖酸转化率如表1所示。优化培养基发酵消耗的葡萄糖和（NH4）2SO4分别为 824.6g和200.6g，原始培养基发酵消耗的葡萄糖和（NH4）2SO4分别为903.8g和 188.6g。相比之下，优化培养基比原始培养基少消耗了8.8%的葡萄糖，多消耗了6.4%的（NH4）2SO4，两种培养基溶液中的C/N（m/m）分别为7.8和9.0。发酵过程结束后，优化培养基溶液中的产酸总量和糖酸转化率分别为588.2g和0.713g酸/g糖，和原始培养基的574.7g和0.636g酸/g糖相比，分别提高了 2.3% 和 12.2% 。

这可能是由于优化培养基成分中的蛋氨酸、糖蜜和谷氨酸含量改变后，培养基中的碳氮比和其他营养成分配比随之改变，菌种的新陈代谢和生长繁殖机制受到影响，不需消耗过多碳源合成生物体，因此菌种生长速度和总生物量均低于原始培养基。菌种生长进入高速产酸期后，消耗的碳源和氮源主要用来生产L－赖氨酸。优化培养基中消耗的C/N为7.8，低于原始培养基中消耗的C/N 9.0。优化培养基利用较低的C/N和较少的葡萄糖原料，生产出了更多的L－赖氨酸，说明优化培养基更有利于菌种高效利用氮源合成L－赖氨酸。

3 结论

对谷氨酸棒杆菌连续培养发酵生产L－赖氨酸进行研究后发现，和原始培养基相比，优化培养基中的菌种消耗的碳源较少，总体生物量较低。发酵结束后，优化培养基中的L－赖氨酸浓度、产酸总量和糖酸转化率分别比原始培养基提高了 6.1%、2.3% 和12.2%，优化培养基进一步提升了L－赖氨酸的发酵指标和生产效率，为降低工业生产成本奠定了基础。

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