乌贼墨多糖对环磷酰胺致小鼠卵巢损伤的保护作用

谷毅鹏，张云波，刘华忠，乐小炎，陶叶杏，肖 为，罗 萍，*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088;2.广东海洋大学农学院，广东湛江 524088;3.广东海洋大学生物化学中心，广东湛江 524088）

乌贼墨来自海洋软体动物乌贼的墨囊，在遇敌时喷出用以逃生，是一种具有多种生理功能的海洋活性物质［1］。乌贼墨多糖（Squid ink polysaccharides，SIP）是乌贼墨中最主要的活性成分之一，具有抗肿瘤［2］、抗氧化［3］、抗菌［4］、增强免疫［5－6］等生物学活性，近年来，本课题组发现并报道了SIP的化学防御功能［7－8］，能有效缓解环磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）对模型动物生殖功能的毒性损伤［9－11］。CP是最常用的化疗抗肿瘤药物，也是治疗自身免疫性疾病最强的烷化剂类药物，在临床上应用十分广泛［12－14］。但是CP又可导致卵巢功能严重损伤，出现卵巢萎缩，间质纤维化，原始卵泡减少，使卵巢功能过早衰竭甚至不孕［15－16］。CP导致的卵巢损伤会对女性患者造成身体和心里上的严重影响，降低女性患者化疗后生活质量和信心，因此寻找能够降低CP的卵巢毒害，保护卵巢功能的药物及方法，已显得尤为重要。本实验通过对雌性小鼠腹腔注射CP来构建卵巢损伤模型，并给予乌贼墨多糖灌胃，以此来进一步探讨SIP对CP致小鼠卵巢损伤的保护作用及可能的机制，为其在临床上的应用寻求一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验动物 清洁级雌性昆明小白鼠 购自广东省医学实验动物中心，体重约18～20g，共40只，在生化中心实验动物房适应性饲养1～2周。

1.1.2 主要试剂 乌贼墨多糖 本实验室制备［11，17］;木瓜蛋白酶 购自北京鼎国生物技术有限公司;注射用环磷酰胺（CP） 购自江苏恒瑞医药股份有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx） 均购自南京建成生物工程研究所;其它所有试剂 均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 KDC－160HR型高速冷冻离心机;FDU－1100型真空冷冻干燥机;UV－2550型紫外可见分光光度计;N－1000型旋转蒸发仪;JY92－Ⅱ型超声波细胞粉碎机;BX51型多功能显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理 将40只雌性昆明小鼠随机分成4组，即对照组、模型组、乌贼墨多糖（SIP）组、治疗组，每组10只。各组实验动物分组及药物处理如表1所示，SIP组和治疗组动物每天灌胃SIP（80mg/kg），对照组和模型组每天磷酸盐缓冲液（PBS）灌胃;同时，模型组和治疗组动物需腹腔注射环磷酰胺（CP），剂量为50mg/kg，每周一次，连续5周，其余两组按同样方法腹腔注射等量生理盐水（NS）。

表1 实验动物分组及药物处理Table 1 Experimental animal grouping and drug treatment

各组实验动物在末次药物处理24h后称重，摘眼球取血，然后脱颈椎处死，迅速取出双侧卵巢，去除周围脂肪及结缔组织，称重，并根据实验需要对卵巢分装保存。常规分离血清，－20℃保存备用。计算小鼠卵巢指数:卵巢指数（%）=每只小鼠卵巢重量/每只小鼠体重×100。

1.2.2 组织病理学检测 将卵巢组织固定于10%甲醛溶液中，梯度乙醇脱水，浸蜡8h，石蜡包埋，5μm切片，HE染色，在光学显微镜下观察卵巢组织结构变化，并统计原始卵泡、初级卵泡、成熟卵泡和卵泡总数。

1.2.3 血清生殖激素的测定 血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）和睾酮（T）水平的检测均严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 卵巢抗氧化指标测定 取一侧卵巢制成5%组织匀浆，备用。卵巢组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）均采用试剂盒说明书方法测定。

1.2.5 数据处理 使用SAS公司开发的JMP7.0软件对实验数据进行处理和分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重及卵巢指数

由表2可以看出，与对照组比较，模型组小鼠卵巢指数明显降低，差异有统计学意义（p＜0.01），模型组小鼠体重也有所降低，但差异并不显著（p＞0.05），表明CP对小鼠的卵巢指数的抑制作用很明显;同模型组相比，治疗组小鼠经SIP灌胃后体重变化不大，卵巢指数虽稍有增加，但差异也不明显（p＞0.05）。

表2 小鼠体重及卵巢指数Table 2 The body weight of mice and ovarian index

2.2 组织病理学观察

图1 小鼠卵巢组织病理学观察Fig.1 Histopathological observation of mouse ovaries

表3 血清性激素水平Table 3 The levels of sex hormones in serum

表4 卵巢组织中抗氧化指标Table 4 The tissue antioxidant index of ovarian

在光镜下对小鼠卵巢组织切片进行观察，如图1所示，对照组（图1A）和SIP组（图1C）卵巢可见大量原始卵泡，较多的初级、生长和成熟卵泡以及黄体，形态规则，间质少;模型组（图1B）卵巢的卵泡数目锐减，其中生长卵泡和成熟卵泡数量下降明显，有的甚至消失，间质有纤维化;治疗组（图1D）卵巢的结构同模型组相比已有比较明显的改善，卵泡总数增加，可见大量初级卵泡，并保存了较多生长卵泡，而且间质纤维化程度有所减轻。通过对各级卵泡进行计数，如图2所示，模型组原始卵泡数、初级卵泡数、成熟卵泡数以及卵泡总数均显著低于对照组，差异具有统计学意义（p＜0.01）;而SIP组与对照组相比，上述卵泡数的差异均不显著（p＞0.05）;但治疗组同模型组比较，原始卵泡数、初级卵泡数、成熟卵泡数以及卵泡总数均有明显增高，且差异极显著（p＜0.01）。结果表明，环磷酰胺能够显著降低小鼠各级卵泡数，破坏卵巢结构，而SIP能够明显缓解CP对小鼠卵巢组织结构和卵泡生长过程的抑制作用，提高各级卵泡数目，增强卵巢的储备能力。

图2 小鼠双侧卵巢各级卵泡总数Fig.2 Total bilateral ovarian follicles in mice

2.3 血清性激素水平

各组血清中性激素水平如表3所示，与对照组相比，模型组小鼠注射CP后，血清中LH水平明显升高，差异极显著（p＜0.01），血清中FSH和T水平也均显著升高（p＜0.05），但E2水平却明显下降（p＜0.05），证明CP能显著降低正常雌性小鼠血清中E2水平，显著升高血清中FSH和T水平，并且能极显著的升高血清中FSH水平;SIP组血清中的上述指标与对照组相差不大，不具统计学意义（p＞0.05）。同模型组比较，治疗组血清中E2水平升高非常显著（p＜0.01），血清中LH水平下降极其显著（p＜0.01），FSH水平也下降明显（p＜0.05），但血清中T水平虽有所下降却不具统计学意义（p＞0.05）;由此可知，SIP能够极显著的抑制CP对雌性小鼠血清中LH和E2水平的影响，也能抑制CP对FSH的影响，但对血清中T水平的改善并不明显。

2.4 抗氧化指标

从表4可以看出，当注射CP后，模型组小鼠卵巢组织中SOD活力和GSH－Px活力均比对照组低，并且差异极显著（p＜0.01）;而经SIP灌胃后，同模型组相比，治疗组小鼠卵巢中SOD活力明显恢复（p＜0.05），GSH－Px活力也显著升高，差异有统计学意义（p＜0.01）;从表4还能看出，与对照组比较，模型组小鼠卵巢MDA含量显著升高（p＜0.01），GSH含量明显降低（p＜0.01），但经SIP灌胃后，治疗组雌性小鼠与模型组相比，卵巢中MDA含量明显降低（p＜0.01），GSH含量显著升高（p＜0.01）。结果表明，SIP能显著抑制CP对小鼠卵巢组织造成的氧化损伤，提高卵巢组织中SOD和GSH－Px活力，降低MDA含量，升高GSH含量，从而有效保护卵巢组织细胞，增强整体抗氧化能力。

3 结论

环磷酰胺（CP）作为应用最广泛的化疗药物，常用于治疗恶性肿瘤及自身免疫疾病，但毒副作用强，易造成卵巢永久性损伤，致使卵巢早衰和不孕。CP导致卵巢功能性损伤的机理目前尚不明确，但一般认为，有丝分裂越活跃的细胞对细胞毒性药物的敏感性越强，而正是由于CP破坏了增殖活跃的卵泡颗粒细胞和通过激活ROS介导的细胞凋亡信号通路，上调了生长卵泡的凋亡比率，导致性激素分泌减少，反馈性引起下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）、垂体促性腺激素（FSH、LH）的分泌增加，加快原始卵泡向生长卵泡的发育，从而使其再次受到CP的破坏，形成恶性循环，最终耗竭原始卵泡的储备［18－20］。本研究证实CP会导致血清中性激素水平失衡，破坏卵巢组织结构，对卵巢内的不同阶段的生长卵泡有严重的杀伤作用，使卵巢产生明显的氧化损伤。

乌贼墨多糖（SIP）是从乌贼墨中提取出来的海洋生物活性物质，具有抗化疗作用，而且是一类高效、无毒、广谱类细胞保护剂。本研究结果显示，SIP能拮抗CP对卵巢的毒害:首先，增加原始卵泡数、初级卵泡数、成熟卵泡数以及卵泡总数（p＜0.01），提高卵巢的储备功能，并在一定程度上修复CP对卵巢组织结构的破坏;其次，调节血清中E2（p＜0.01）、FSH（p＜0.05）和LH（p＜0.01）恢复至正常水平，降低CP对血清中性激素的影响;最后，还能显著的提高卵巢组织中SOD活力（p＜0.05）和GSH－Px活力（p＜0.01），降低 MDA含量（p＜0.01），升高 GSH含量（p＜0.01），抑制卵巢组织的氧化损伤。SIP对CP致小鼠卵巢损伤产生的保护作用，可能是通过提高卵巢组织的抗氧化能力，缓解了CP对卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞的毒性损伤，抑制生长卵泡的不正常凋亡，调控下丘脑－性腺轴对性激素的正常分泌，从而保护卵巢组织结构，增强卵巢的储备能力。然而，目前关于CP拮抗剂在化疗过程中对卵巢的保护作用已有大量研究，但其作用机制还存有较大争议，因此对于SIP的这种保护作用以及机理还需要更多的科学实验来证实。

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