适于标记核酸适配子胶体金的制备及性能

解瑶，刘中成，张艳芬，赵丽健，刘利鹏

（1.河北大学 药学院，河北 保定 071002；2.河北大学 实验室管理办公室，河北 保定 071002）

1990年，Tuerk等首次利用指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选出与噬菌体T4DNA 聚合酶有高亲和力和特异性结合的寡核苷酸，即核酸适配子［1］.适配子功能与单克隆抗体类似，但在诸多方面优于抗体：可化学合成、性质稳定、容易修饰、可以用半抗原小分子作为靶标进行筛选等，在化学、药学等领域受到诸多学者的关注［2］.近年来，基于适配子制作传感器，检测靶物质，正成为适配子应用的新热点，其中胶体金标记适配子可制作光学、化学传感器，它具有和免疫胶体金相同的优势，可简单、快速地检测靶物质，且无需专业人员和大型仪器［3－5］.

制备胶体金标记抗体主要利用胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子正电荷基团牢固结合，目前对于适于标记抗体的胶体金制备工艺已有很多报道，但有关胶体金标记适配子的研究相对较少［6－7］.宋宏新等［8］制备适于标记抗体的胶体金时仅对柠檬酸三钠和抗坏血酸2种还原剂进行了优化，未考虑其他因素的影响，以及各种参数之间的交叉影响.杨玉新等［9］人也只是并列比较4种还原剂制备单分散胶体金颗粒的方法.本实验在前人对适于标记抗体胶体金制备研究基础上，采用了固定变量法，优化了制备适于标记适配子胶体金的条件.因为适配子可通过正电荷与胶体金颗粒形成静电吸引作用，所以胶体金颗粒均匀度、颗粒大小等因素将直接影响适配子的标记以及传感器的灵敏度.考虑到胶体金与蛋白及核酸结合的不同，探索适合标记核酸适配子的胶体金制备工艺，将为适配子在物质检测分析中的应用提供基础.

本文系统地比较了柠檬酸三钠、抗坏血酸、鞣酸等还原剂的种类及其加入量，并对pH 值、反应时间、沸腾时间等关键参数进行了优化.将所制备胶体金与适配子进行反应，经紫外可见光谱扫描和透射电镜鉴定，获得了满足标记核酸适配子要求的胶体金.

1 材料与方法

1.1 实验材料

氯金酸（HAuCl4）购自Aladdin公司；链霉素购自中国药品生物制品检定所；柠檬酸三钠购自天津市北辰骅跃化学试剂厂；抗坏血酸购自上海至新化工有限公司；鞣酸购自天津市达润能化工有限公司；实验所用的单链和双链核酸及链霉素适配子均由上海生工公司合成.其余均为国产分析纯试剂.

1.2 胶体金制备

用王水浸泡所用玻璃容器，蒸馏水清洗5次直至干净，烘干备用.用超纯灭菌水配制0.1g／L 氯金酸溶液.首先对不同还原剂进行条件优化：分别取20mL氯金酸溶液，调节pH 值为3.0，加入到3个50mL的圆底烧瓶中，做好标记，搅拌煮沸，分别立即加入500μL 10g／L 的柠檬酸三钠、抗坏血酸、鞣酸3种不同的还原剂，颜色变为酒红色后，继续加热搅拌6min，撤去热源，搅拌至室温.将所得胶体金溶液转入棕色瓶中，4 ℃保存.同时采用单一变量法对还原剂加入量、反应溶液pH 值、加入柠檬酸三钠前的沸腾时间以及加入还原剂变色后继续煮沸时间等反应条件进行优化，利用紫外可见光谱扫描法对优化结果进行检测.

1.3 胶体金性能测定

将不同长度单链和双链DNA（20，80，3 482bp）用灭菌水配制成100nmol／L 溶液.不同长度的单链DNA（ssDNA）煮沸5min，冰浴10min，加入到50μL胶体金中室温震荡孵育1h，双链DNA（dsDNA）则直接加入到50μL胶体金中室温震荡孵育1h，加入50μL 200mmol／L NaCl，充分反应10min，检测反应结果.标记ssDNA（80bp）的胶体金以及未标记ssDNA 的胶体金（纯胶体金），加入NaCl后的结果用透射电镜进行鉴定.

1.4 标记适配子的胶体金性能测定

50μL胶体金中加入100nmol／L链霉素特异性适配子室温孵育1h，制得了标记适配子的胶体金［8］.在所制得的标记适配子胶体金中，分别加入0，0.8，1.6μmol／L 链霉素，室温孵育2h，加入200 mmol／L NaCl.观察颜色变化，用紫外可见光谱扫描和透射电镜对其结果进行综合评价.

2 结果与讨论

2.1 最佳还原剂的确定

采用柠檬酸三钠制备胶体金，得到的胶体金呈酒红色，外观效果良好，透明，无悬浮物出现；采用抗坏血酸制备胶体金，得到的胶体金溶液呈紫红色，透明，无漂浮物，符合外观要求；采用鞣酸制备的胶体金，颜色为亮红色，透明，无悬浮物.对400～800nm 处吸光值进行扫描，得到扫描图谱，如图1所示，柠檬酸三钠作为还原剂时峰宽相对于其他较窄，说明胶体金颗粒大小均一，分散良好［1］.所以选择柠檬酸三钠作为还原剂.

2.2 柠檬酸三钠添加量的确定

10g／L柠檬酸钠添加量分别为200，300，400，500，600μL 时，制备得到的胶体金均透明且无悬浮物出现.其中，柠檬酸三钠添加量为200μL 时溶液呈紫色，300，400μL 时呈紫红色，500，600μL 呈酒红色.经400～800nm 紫外可见分光光度计扫描，如图2所示，柠檬酸三钠添加量为200μL 时峰位置在535nm 处，300，400μL时峰位置在525nm 处，500，600μL时峰位置在520nm 处，由此可知随着还原剂添加量增加，峰位置逐渐变小，颗粒也逐渐变小.所以选择500μL为柠檬酸三钠的最佳添加量.

图1 不同还原剂制得胶体金的扫描图谱Fig.1 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different reductants

图2 不同柠檬酸三钠添加量制备胶体金扫描图谱Fig.2 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different amounts of sodium citrate

2.3 胶体金溶液pH 值的确定

在溶液pH 值分别为3.0，4.0，6.0，8.0，10.0的情况下制备胶体金.在pH 为3.0，4.0时，溶液呈酒红色，且峰型和峰宽相同，峰位置都在520nm 左右；在pH 为6.0，8.0时，溶液呈紫红色，峰型和峰宽接近，峰位置都在539nm 左右；pH 为10.0时，颜色为浅紫色，峰位置在530nm 左右.从图3可以看出，降低pH 值，吸收峰的最大值向波长短的方向移动，所以，选择3.0作为最优pH.

图3 不同pH 值条件下所得的胶体金的扫描图谱Fig.3 Spectrum scanning of AuNPs synthesized in different pH

2.4 氯金酸沸腾时间的确定

如图4所示，0，2，4min时的最大吸收峰接近，基本处于523nm 处，此时制备得到的胶体金溶液呈酒红色，透明度较高，色泽稳定.而沸腾时间往后推移，经紫外分光光度计扫描得到的最大吸收峰有所偏移，且得到的溶液颜色加深，一般呈现紫色，若时间再延长，甚至会出现黑色物质，所得到的胶体金溶液较之前稳定性较差.

2.5 不同反应时间的确定

改变氯金酸在沸腾后加入柠檬酸三钠时的反应时间，所得到胶体金的颜色变化如图5所示，在0，2，4，6，8min时，颜色依次呈现为浅粉色、粉色、红色、酒红色、紫红色.紫外扫描图谱中反应6min，吸光度最高.说明在0.1g／L氯金酸反应体系为20mL和500μL柠檬酸三钠溶液条件下反应6min时溶液的颜色为酒红色，符合胶体金制备要求.

图4 氯金酸不同的初始沸腾时间所得胶体金的扫描图谱Fig.4 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different times of boiling

图5 不同反应时间制得胶体金的光谱Fig.5 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different reaction time

2.6 不同长度DNA 与胶体金反应

胶体金能够分散良好的原因是胶体金表面柠檬酸离子的斥力作用，而适配子标记胶体金能够分散良好的原因是适配子的负电子斥力和空间位阻的共同作用，比离子斥力作用要稳定很多［12］.所以标记适配子的胶体金加入盐后，不会发生聚沉.由图6可知，长度分别为20，80，3 482bp的ssDNA 与胶体金孵育后，加入NaCl后颜色不变，而长度为20，80，3 482bp的双链DNA 与胶体金孵育，加入NaCl后，颜色由红变紫.其中阴性对照为不加适配子的胶体金，加入NaCl后，颜色变紫（图6）.电镜结果如图7所示，标记ssDNA 的胶体金，加入NaCl后颜色不变，分散保持均匀，未标记适配子的胶体金，加入NaCl后，发生聚沉.由此可知，本研究制备的胶体金可与长度大小不同的单链核酸结合，不产生静电作用，从而保护胶体金不发生聚沉，而双链DNA 则不能保护胶体金，表明本实验制备的胶体金可稳定地标记单链核酸［13－14］.

图6 不同长度DNA与胶体金反应结果Fig.6 Results of different lengths of DNA－lable AuNPs

胶体金粒径越小，比表面积就越大，电镜检测结果显示本实验所制备的胶体金粒径为15～20nm，而Cvak等［15］研究结果表明：标记抗体最适合胶体金粒径范围是15～40nm，二者较为接近，可能由于抗体和适配子与胶体金结合的原理相同，均是利用胶体金正电荷与抗体或适配子的负电荷静电引力相互作用.

图7 胶体金占ssDNA反应电镜检测结果Fig.7 Results of the reaction between aptamers and AuNPs by TEM

2.7 标记适配子的胶体金性能的测定

已知标记适配子的胶体金加入盐后，不会发生聚沉.加入半抗原小分子链霉素后，适配子脱离了胶体金，和链霉素发生特异性结合，加入盐后，胶体金发生聚沉，颜色发生变化.且随着链霉素浓度的增加，聚沉程度加大，结果显示颜色由红变紫再变蓝（图略），且紫外分光光度计扫描图谱显示，620nm 处峰高逐渐增大，说明聚沉彻底（图8）.扫描电镜结果与此相同（图9）.

图8 不同浓度链霉素加入标记适配子的胶体金的光谱Fig.8 Spectrum scanning of different concentaions of streptomycin add to aptamer－labled AuNPs

图9 不同浓度链霉素加入到标记适配子的胶体金的TEMFig.9 Results of different concentations of streptonycin add to aptamer－labled AuNPs by TEM

3 结论

胶体金在食品检测、医学初诊、环境监测等诸多领域得到了广泛的应用，制备方法也有诸多文献报道，但标记核酸适配子胶体金的成熟制备工艺未见报道［16－17］.本实验对还原剂类型及加入量、pH 条件、初始沸腾时间及反应时间等参数进行了优化，建立了适于标记适配子胶体金的制备工艺，并对所制备的胶体金进行了性能鉴定，为制备基于适配子的胶体金比色传感器奠定了基础.

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