液相色谱-串联质谱法测定葡萄中链霉素和双氢链霉素

刘真真, 齐沛沛, 何付香, 汪志威, 狄珊珊, 徐 浩, 赵慧宇, 王 强, 王新全

(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室, 浙江 杭州 310021)

链霉素(streptomycin, STR)属于氨基糖苷类抗生素;双氢链霉素(dihydrostreptomycin, DSTR)是链霉素中链霉糖部分的醛基氢化后所获得的另一种链霉素衍生物,与链霉素功效相似[1]。链霉素和双氢链霉素作为饲料添加剂和抗菌剂在农业、牧业和养殖业上得到广泛应用[2]。然而,自1985年日本学者小笠原发现链霉素可以诱导葡萄无核结实以来,链霉素在巨峰、玫瑰金等葡萄生产中得以广泛使用[3]。链霉素和双氢链霉素存在一定的耳毒性、肾毒性、致畸和致癌作用,其可通过食物链进入人体,危害人类健康[4]。无核葡萄食用时无须吐籽,深受消费者喜爱。但葡萄中链霉素或双氢链霉素残留过量,会对人体造成严重危害。因此,链霉素和双氢链霉素在葡萄中的残留量及其安全性引起了消费者的担忧。

链霉素和双氢链霉素作为重要的抗生素类药物，国内外已开展了其在动物源性产品中残留的检测技术研究。常用的检测方法主要有酶联免疫法[5]、分光光度法[6]、液相色谱法[7,8]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9-21]等。其中,LC-MS/MS抗背景干扰能力强,具有高灵敏度、高选择性和高通量分析的优势,被广泛应用于牛奶、蜂蜜、肌肉等食品中链霉素和双氢链霉素的残留分析。然而,关于葡萄等植物源性样品中链霉素和双氢链霉素的分析研究却鲜有报道。因此,为保证葡萄质量安全,本研究拟采用LC-MS/MS建立快速、简便、灵敏度高的定量分析链霉素和双氢链霉素残留的方法。目前,LC-MS/MS分析链霉素和双氢链霉素残留量主要存在两个问题:一是在色谱分析的流动相中添加离子对试剂,增加其保留和响应值,但在测定过程中离子对试剂难雾化,致使仪器灵敏度下降[11-13,16,21];二是前处理过程复杂,大多需经两次固相萃取小柱萃取净化,耗时长,试剂消耗量大[1,22]。本研究选取在前处理过程中添加1-己烷磺酸钠离子对试剂,采用Oasis HLB单柱即可达到理想富集效果,经后续处理去除离子对试剂,避免在分析过程将其带入质谱而导致仪器灵敏度下降;同时通过优化色谱条件,选取Waters HSS T3色谱柱增强其色谱响应值,从而提高链霉素和双氢链霉素分析的检测灵敏度。

本研究以巨峰葡萄为代表,建立了葡萄中链霉素和双氢链霉素的样品前处理和定量分析方法。研究了色谱柱及流动相组成对链霉素和双氢链霉素分离和响应值的影响,同时对影响链霉素和双氢链霉素残留分析准确度及精确度的关键因素进行优化研究,以期为葡萄中链霉素和双氢链霉素污染水平研究及最大残留限量制定提供方法依据。

表 1 链霉素和双氢链霉素的质谱参数

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nexera X2 LC-30AD超高效液相色谱仪、8050三重四极杆质谱仪、Labsolution软件(用于仪器控制、数据采集和结果分析)(日本Shimadzu公司);色谱柱为Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美国Waters公司); Filter Unit滤膜(0.22 μm,天津Agela Technologies公司); Biofuge Primo R高速离心机(德国Thermo公司);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

链霉素和双氢链霉素标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司);商品化Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL,美国Waters公司);甲醇(色谱纯,美国Merck公司);甲酸、磷酸(色谱纯,美国Tedia公司);磷酸氢二钠(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司);实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水系统制备,美国Millipore公司); 1-己烷磺酸钠(分析纯,上海Macklin公司)。

巨峰葡萄、新郁葡萄、红提葡萄、夏黑葡萄等购于浙江省杭州市超市。将葡萄样品去除果蒂,高速匀浆混匀,然后放入冰箱中冷冻保藏(-18 ℃),待用。

1.2 实验方法

1.2.1样品前处理

提取:称取葡萄样品5.00 g(±0.05 g),置于50 mL离心管中,准确加入10 mL磷酸溶液(pH=2),超声萃取15 min,涡旋1 min,以7 000 r/min离心3 min,取全部上清液(约12 mL);随后向上清液中加入2 mL 1-己烷磺酸钠(0.5 mol/L),混匀,静置10 min,待净化。

净化:将上述待净化液加入预先经5 mL甲醇、5 mL水活化平衡的Oasis HLB固相萃取柱内,待样液全部流尽后,依次用5 mL磷酸溶液(pH=2)、10 mL水淋洗;负压抽干后,用6 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脱,收集全部洗脱液,氮吹至干,用1 mL甲醇复溶,涡旋混匀后,过0. 22 μm滤膜,供LC-MS/MS分析。

1.2.2分析条件

色谱柱为Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱温为35 ℃；流动相为水-甲醇(60∶40, v/v),其中水相中含有0.1%甲酸；流速为0.3 mL/min；进样量为2 μL。

电喷雾电离源,正离子模式;多反应监测模式(MRM);加热温度400 ℃;喷雾电压+3 500 V。链霉素和双氢链霉素化合物分别由两对母离子和子离子对共同确定,链霉素和双氢链霉素前体离子、产物离子及相应的碰撞能和偏差见表1。

2 结果与讨论

2.1 方法优化

2.1.1色谱柱的选择

本研究考察了3种色谱柱Waters BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Phenomenon LC-HILIC(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)对链霉素和双氢链霉素保留和响应的影响。当流动相为水-甲醇(50∶50, v/v),且水相中含有0.1%的甲酸时，采用上述色谱柱分别对0.25 mg/L(甲醇配制)的链霉素和双氢链霉素标准溶液进行分析测定,色谱图见附图1(详见http://www.chrom-China.com)。可以看出,链霉素和双氢链霉素在HILIC柱上的保留时间有所增加,色谱峰形较差,为准确定量带来困难。链霉素和双氢链霉素在C18、T3色谱柱上的保留时间相当,但在T3色谱柱上的响应明显高于C18色谱柱。因此,选取T3色谱柱用于链霉素和双氢链霉素的分析测定。

2.1.2流动相的选择

本研究以水和甲醇为流动相,其中水相中加入能与其互溶的挥发性缓冲溶液甲酸来改善化合物的保留和色谱峰形[23]。实验分别考察甲酸体积分数(0、0.1%和0.5%)和水-甲醇的比例(20∶80～80∶20, v/v)对色谱峰形和灵敏度的影响(见附图2和附图3)。

当流动相为水-甲醇(50∶50, v/v)时,水相中加入甲酸增加了链霉素和双氢链霉素在T3色谱柱上的保留和响应值;然而,甲酸的添加量对目标物在色谱柱上的保留时间影响不显著,却会造成化合物响应值的变化,当甲酸用量为0.5%时,目标物在色谱柱上的响应值显著降低。因此,在水相中加入0.1%甲酸作为修饰剂。

在水相中加入0.1%甲酸后,进一步调整流动相中水和甲醇的比例,以考察最佳的流动相条件。当流动相中水与甲醇的体积比由20∶80升至60∶40时,链霉素和双氢链霉素在T3色谱柱上的保留时间相当,在色谱柱上的响应值呈上升趋势;而水与甲醇的体积比由60∶40升至80∶20时,目标物在色谱柱上的响应值明显降低,这可能是因为有机溶剂的比例降低,导致离子化效率的降低,从而使化合物响应值降低。因此,最终确定最佳的流动相为水-甲醇(60∶40, v/v),其中水相中含有0.1%甲酸。

2.1.3提取液的选择

在链霉素和双氢链霉素的分析测定中,样品通常以磷酸[22,24]和磷酸盐缓冲溶液[25]作为提取液。本研究考察了水、磷酸(pH=2)、磷酸氢二钠(pH=7)3种提取溶液对葡萄样品中链霉素和双氢链霉素的提取效率。实验过程参照1.2.1节,3种提取溶液对链霉素和双氢链霉素提取回收率见图1。结果可知,磷酸(pH=2)对葡萄中链霉素和双氢链霉素的提取效果最佳,链霉素和双氢链霉素的提取回收率分别为81.0%和78.4%。因此,本研究选取磷酸(pH=2)作为提取溶液,在超声波辅助下对葡萄样品中的链霉素和双氢链霉素进行提取。

图 1 不同提取溶剂对链霉素和双氢链霉素回收率的影响(n=3)Fig. 1 Effects of the different extraction solvents on the recoveries of the STR and DSTR (n=3) PA: phosphoric acid; DHP: disodium hydrogen phosphate.

2.1.4离子对试剂用量的选择

图 2 1-己烷磺酸钠用量对链霉素和双氢链霉素回收率的影响(n=3)Fig. 2 Effects of dosages of sodium hexane-1-sulfonate on the recoveries of STR and DSTR (n=3)

链霉素、双氢链霉素中含有糖苷键,极性较大,在固相萃取柱上的保留不理想。因此,样品经固相萃取柱净化和富集前,需向提取液中添加离子化试剂以增加其保留[1]。本研究以0.5 mol/L 1-己烷磺酸钠为离子试剂,与目标物形成离子对,从而增加Oasis HLB固相萃取柱对链霉素和双氢链霉素的吸附能力,提高回收率。葡萄样品经磷酸(pH=2)超声提取、涡旋、离心后,取上清液，然后向其加入不同体积(0、1、2、3和4 mL)的0.5 mol/L 1-己烷磺酸钠。由图2可以看出,样液在不加1-己烷磺酸钠时,Oasis HLB固相萃取柱对链霉素和双氢链霉素的吸附作用较弱,1-己烷磺酸钠的加入增加了链霉素和双氢链霉素在固相萃取柱上的保留。且在一定用量范围内，随着1-己烷磺酸钠的加入其回收率也随之增高,当其加入量为2.0 mL时,链霉素和双氢链霉素的回收率最佳。因此,本研究选择在提取液中加入2.0 mL 0.5 mol/L 1-己烷磺酸钠溶液来增加目标物在固相萃取柱上的保留。

2.1.5洗脱溶剂的优化

洗脱溶剂在固相萃取及净化过程中起重要作用，因此选择合适的洗脱溶剂至关重要。在极性化合物分析过程中,甲醇、乙腈(ACN)等为常用的固相萃取洗脱溶剂。因此,本方法探究了不同洗脱溶剂对链霉素和双氢链霉素的脱附效果,并对洗脱液的体积进行了优化。不同洗脱溶剂(甲醇、1%甲酸甲醇、5%甲酸甲醇、10%甲酸甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、10%甲酸乙腈)对链霉素和双氢链霉素的洗脱效果见图3a。可以看出,甲醇的洗脱能力优于乙腈,甲酸的加入进一步提高了洗脱能力;当用10%甲酸甲醇进行洗脱时,链霉素和双氢链霉素的洗脱效果最佳。因此,选择10%甲酸甲醇作为洗脱溶剂进行下一步实验。

图 3 (a)洗脱溶剂及其(b)体积对链霉素和双氢链霉素回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effects of (a) elution solvents and (b) their volumes on the recoveries of STR and DSTR (n=3) ME: methanol; FA: formic acid; ACN: acetonitrile.

此外,洗脱溶剂的体积同样是固相萃取中影响结果的关键性因素。本研究进一步探究不同体积(2、3、4、5和6 mL)的10%甲酸甲醇溶液对目标分析物回收率的影响(见图3b)。当10%甲酸甲醇溶液的洗脱体积为6 mL时,链霉素和双氢链霉素的回收率最佳,分别为96.6%和75.4%。因此,选择6 mL 10%甲酸甲醇溶液作为洗脱溶剂。

2.2 方法验证

2.2.1线性关系和检出限

配制链霉素和双氢链霉素的基质标准溶液,其质量浓度分别为2、5、10、25、50、100、250、400 μg/L。经LC-MS/MS分析后,以链霉素和双氢链霉素色谱峰面积(y)对其质量浓度(x, μg/L)进行线性拟合,得出回归方程及相关系数(R2)。结果显示,链霉素和双氢链霉素在2～400 μg/L范围内具有良好的线性关系,线性方程分别为y=122.7x+522.0和y=568.5x+3 219;线性相关系数分别为0.999 1和0.999 7。检出限(LOD)为3倍信噪比所对应的化合物质量浓度,链霉素和双氢链霉素的LOD值为1 μg/L。根据欧盟文件SANTE/11813/2017规定,定量限(LOQ)为添加回收试验中回收率满足实验工作需求的最低添加浓度水平。本实验的最低添加水平为5 μg/kg时,链霉素和双氢链霉素的回收率分别为91.9%和76.8%(见表2),故本方法中链霉素和双氢链霉素的LOQ为5 μg/kg。

表 2 葡萄中链霉素和双氢链霉素在不同添加水平下的回收率(n=3)

2.2.2回收率及精密度

使用空白葡萄基质进行添加回收率试验,添加水平分别为5、10、20和40 μg/kg(每个添加水平平行测定3次),按照本方法进行试验,结果见表2。链霉素和双氢链霉素在不同添加水平下平均回收率为76.8%～91.9%, RSDs为0.4%～10.2%。方法的准确度和精密度均符合分析要求。

2.2.3实际样品分析

为验证该方法的适用性,本研究选取空白无籽红提、新郁葡萄、夏黑葡萄等样品进行添加回收试验。添加水平为20 μg/kg(每个添加水平平行测定3次)。链霉素和双氢链霉素在20 μg/kg添加水平下的平均回收率分别为77.2%～83.9%和70.8%～78.9%, RSD为3.0%～15.6%。本方法的准确度和精密度均符合葡萄中链霉素和双氢链霉素的分析要求。

3 结论

本研究建立了葡萄中链霉素和双氢链霉素的定量分析方法。本方法准确度和精密度高,适用于葡萄中链霉素和双氢链霉素含量的定量分析,并可为葡萄中链霉素和双氢链霉素污染水平研究及最大残留限量制定提供方法依据。