HPLC法测定双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素的含量Δ

周 琳（重庆市食品药品检验检测研究院/重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

双氢青蒿素哌喹片为双氢青蒿素和磷酸哌喹的复方制剂。双氢青蒿素为青蒿素衍生物[1-2]，是青蒿素体内活性物质，对疟原虫无性体有较强杀灭作用，能迅速杀灭疟原虫，控制疾病症状。双氢青蒿素和磷酸哌喹合用具有协同作用，可延缓疟原虫耐药性的产生[3]。《中国药典》2010年版第一增补本收载了双氢青蒿素哌喹片，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定双氢青蒿素的含量，但该方法不能有效排除磷酸哌喹的影响。本文参考《国际药典》2011 V2.2版中双氢青蒿素的含量测定方法[4]，对现行标准中的测定方法进行了改进。

1 材料

2695型HPLC仪，包括2998型二极管阵列检测器和Empower工作站（美国Waters公司）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：200 W，频率：40 kHz）；ME215S型十万分之一天平（德国Sartorius公司）。

双氢青蒿素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100184-201202，纯度：99.94%），青蒿素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100202-201004，纯度：100%）；双氢青蒿素哌喹片（华立岩康制药有限公司，批号：011110、010212、010512）；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters YMC-Pack ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：216 nm；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取双氢青蒿素对照品约25 mg，精密称定，置于25 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）适量，超声处理10 min使溶解，放冷，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 临用新制。取本品10片，精密称定，研细，取粉末适量（相当于双氢青蒿素约25 mg），精密称定，置于25 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）适量，超声处理10 min使溶解，冷却，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。

2.2.3 空白溶液 按处方比例配制无双氢青蒿素的阴性对照品，精密称取相当于双氢青蒿素约25 mg的粉末，置于25 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）适量，超声处理10 min使溶解，冷却，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为空白溶液。

2.3 系统适用性试验

取双氢青蒿素、青蒿素对照品各适量，精密称定，加乙腈-水（80∶20，V/V）超声处理10 min，并稀释制成每1 ml中含双氢青蒿素和青蒿素各1 mg的系统适用性溶液。精密吸取20 μl注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，双氢青蒿素（呈两个色谱峰）第一个色谱峰与青蒿素峰相比，相对保留时间为0.6；各组分峰之间的分离度＞2.0；理论板数以β-双氢青蒿素峰计算＞3 000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 空白干扰试验

分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。按外标法计算供试品溶液中双氢青蒿素的含量，色谱见图1。结果表明，空白溶液无干扰。

2.5 线性关系考察

精密称取双氢青蒿素对照品0.482 5 g，置于200 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）适量，超声处理10 min使溶解，置37℃水浴中保温1 h，冷却后用流动相稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为2.412 mg/ml的双氢青蒿素标准溶液。精密量取双氢青蒿素标准溶液适量，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀释并制成双氢青蒿素质量浓度分别为1.930、0.965 0、0.482 5、0.096 50、0.048 25、0.009 650 mg/ml的标准溶液。按“2.1”项下色谱条件分别进样20 μl测定，记录色谱图。以质量浓度（x）为横坐标、双氢青蒿素两个峰面积之和（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝3.086 8×107x+28.833（r＝0.999 9）。结果表明，双氢青蒿素的质量浓度在0.009 650～1.930 mg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.6 双氢青蒿素双峰转换

精密称取双氢青蒿素原料10.00 mg，精密加入乙腈-水（60∶40，V/V）10 ml，超声处理10 min使溶解，连续进样30次（每次运行时间14 min，等度）。结果，峰面积之和的RSD为0.80%，表明双氢青蒿素溶液在6 h内两峰面积间的比例变化较大，但两峰面积之和基本一致，对测定结果无影响。

2.7 定量限与检测限

精密称取双氢青蒿素对照品20.04 mg，置于100 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）适量，超声处理10 min使溶解，并稀释至刻度，摇匀；再精密量取1.0 ml，置于100 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样5 μl测定，记录色谱图。按信噪比为10计算定量限、以信噪比为3计算检测限。结果，α-双氢青蒿素的定量限、检测限分别为1.78、0.533 ng；β-双氢青蒿素的定量限、检测限分别为7.39、2.22 ng。

2.8 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，按外标法以双氢青蒿素两个峰面积之和计算。结果，RSD为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液适量，在室温下放置0、1.5、3、4.5、6.5、8.5、10.5、14.5 h时按“2.1”项下色谱条件分别进样20µl，以双氢青蒿素两个峰面积之和计算。结果，RSD为0.31%，说明供试品溶液在14.5 h内稳定性良好。

2.10 重复性试验

取同一批样品（批号：011110）适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，按外标法以双氢青蒿素两个峰面积之和计算。结果，RSD为0.5%，表明本方法重复性良好。

2.11 加样回收率试验

精密称取同一批样品（批号：011110）适量，共9份，每3份为一组，分别精密加入相当于双氢青蒿素对照品质量浓度80%、100%、120%的溶液各适量，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

2.12 样品含量测定

取3批样品及双氢青蒿素对照品各适量，按照“2.2”项下方法配制供试品和对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算样品含量，结果以标示量的百分含量表示，详见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

双氢青蒿素哌喹片现行质量标准收载于《中国药典》2010年版第一增补本[5]中，其双氢青蒿素含量测定方法为HPLC法，检测波长为210 nm，本文参照国际药典2011 V2.2版[4]将检测波长改为216 nm，既能保证双氢青蒿素含量测定的灵敏度，同时又能相对减少末端吸收的影响。

现行质量标准流动相为乙腈-水（60∶40，V/V），等度洗脱。本试验中发现，等度洗脱时磷酸哌喹的保留时间较长，不易洗脱，而且磷酸哌喹的色谱峰会影响双氢青蒿素的色谱峰，出现峰重叠等现象。因此，本文采用乙腈和水的梯度洗脱方式，将磷酸哌喹洗脱，避免其对双氢青蒿素含量测定的影响。

综上所述，本方法准确、简便、快速，可用于双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素的含量测定。

[1]韦国峰，何有成，黄祖良.双氢青蒿素的制备及其含量测定[J].右江民族医学院学报，2001，23（5）：691.

[2]王满元.青蒿素类药物的发展历史[J].自然杂志，2012，34（1）：44.

[3]韩涛，代勇.简述使用青蒿素联合西药疟疾的研究进展[J].当代医药论丛，2015，13（6）：10.

[4]World Health Organization.The international pharmacopoeiaFourth Edition Second Supplement[EB/OL].（2011）[2013-07-25].http：//apps.who.int/phint/en/p/docf/.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典：第一增补本[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：271.