CD147对前列腺癌PC-3细胞自噬的影响*

方 芳， 冯 淳， 姚 杨， 马潇潇， 王立国

(1吉林医药学院免疫学教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 132011)

CD147对前列腺癌PC-3细胞自噬的影响*

方 芳1， 冯 淳1， 姚 杨1， 马潇潇1， 王立国2△

(1吉林医药学院免疫学教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 132011)

目的： 研究白细胞分化抗原(CD)147在体外对前列腺癌PC-3细胞的自噬作用。方法: 通过氨基酸饥饿法建立自噬模型，免疫印迹技术检测CD147的表达。利用RNA干扰CD147表达的细胞系，免疫印迹技术检测自噬蛋白LC3-I和LC3-II的表达；台盼蓝排斥实验检测细胞的死亡情况。结果: 在PC-3细胞自噬模型中，随着饥饿诱导时间延长，CD147表达逐渐升高。用RNA干扰技术降低CD147表达后，与阴性对照组比较，在自噬模型中CD147干扰组自噬相关蛋白LC3-II表达增多；并且细胞死亡数量明显增加，阴性对照组细胞死亡率分别为(19.3±3.1)%和(22.3±3.5)%，而在CD147干涉组细胞死亡率为(38.4±3.1)%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论: 在前列腺癌PC-3细胞中CD147抑制饥饿诱导的自噬，减少自噬性细胞死亡的发生。

抗原, CD147； PC-3细胞； 自体吞噬

自噬是细胞内衰老或受损的细胞器或长寿命蛋白被包裹运送到溶酶体降解的过程，通过自噬实现自我更新和维持稳态的一个重要机制。CD147在前列腺癌细胞中表达升高，其作用为抑制肿瘤细胞凋亡[1]、促进肿瘤转移和侵袭[2]、血管生成[3]和参与肿瘤细胞的能量代谢等[4]。研究表明，CD147在肝癌细胞中能够抑制自噬的发生，防止过度自噬导致的细胞死亡，对肿瘤细胞具有保护作用[5]。但CD147是否参与前列腺肿瘤细胞的自噬还不清楚。本研究旨在观察CD147对前列腺癌细胞自噬功能的影响，以探讨其在前列腺癌发生发展中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料和主要试剂

RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株由本实验室保存[6]； DMEM-F12 培养液购自Gibco；胎牛血清购自HyClone；EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)购自Invitrogen；兔抗CD147、LC3 和β-actin抗体购自GeneTex；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RIPA、PMSF、BSA 和Bradford 法蛋白测定试剂盒均购自江苏海门市碧云天生物技术研究所。

2 主要方法

2.1 细胞培养 前列腺癌PC-3细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM-F12 培养液中，置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，融合度达80% 时传代。

2.2 前列腺癌饥饿诱导自噬模型建立 细胞接种到6孔板，37 ℃、5% CO2孵育24 h。细胞用EBSS缓冲液洗涤2次，加入2 mL EBSS缓冲液在37 ℃、5% CO2培养细胞建立饥饿缺乏诱导的自噬细胞模型[7]。

2.3 Western blotting检测CD147和LC3 蛋白的表达 取30 μg蛋白SDS-PAGE 凝胶电泳，将凝胶上蛋白移至醋酸纤维素膜，于50 g/L 脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜，加兔抗CD147和LC3 抗体(1∶1 000)，小鼠抗β-actin 抗体(1∶3 000)，4 ℃过夜。TBST 洗膜，分别加HRP 标记的山羊抗兔抗体(1∶3 000)室温避光孵育2 h。TBST 洗膜后，加底物发光显影。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。

2.4 细胞死亡的检测 将细胞接种到24孔培养板中，加入EBSS缓冲液37 ℃、5% CO2培养12 h。将培养板中细胞用消化液消化并离心收集细胞，取100 μL细胞悬液，加100 μL 0.8%台盼蓝溶液，混匀，每个样品至少计数200个细胞，并重复3次，蓝色细胞被记为死亡细胞，迅速用计数板计数。

3 统计学处理

数据采用SPSS 11.0软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较行方差分析(ANOVA)，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 PC-3细胞自噬模型中CD147的表达变化

图1 所示， PC-3细胞用EBSS饥饿3 h、6 h、9 h、12 h和24 h后，结果表明随着饥饿时间延长，CD147蛋白表达逐渐升高，提示CD147分子参与饥饿诱导的PC-3细胞自噬。

2 CD147抑制饥饿诱导细胞的自噬

细胞在EBSS中培养12 h后，与阴性对照组PC-3 和PC-3/scrambled细胞比较，CD147干扰组细胞LC3-II的表达显著提高，LC3-II/LC3-I比值提高(P<0.05),见图2，提示沉默CD147的表达后，前列腺癌细胞自噬显著增高。

Figure 1.Change of CD147 expression by starvation-induced autophagy in PC-3 cells detected by Western blotting.

图1 PC-3细胞饥饿后CD147蛋白表达的变化

Figure 2.Western blotting analysis of LC-3 protein level in the PC-3 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC-3 or PC-3/scrambled.

图2 PC-3细胞LC3蛋白的表达

3 CD147抑制饥饿诱导自噬性细胞死亡

细胞在EBSS培养12 h后结果表明，阴性对照组PC-3和PC-3/scrambled细胞死亡率分别为(19.3±3.1)%和(22.3±3.5)%，而在CD147干扰组PC-3/shCD147细胞死亡率为(38.4±3.1)%，与阴性对照组比较有显著差异(P<0.05)。这提示在饥饿诱导的自噬中CD147能增强细胞存活。

讨 论

自噬是指细胞在营养缺乏或应激条件下通过消化自身细胞内的蛋白、细胞器和胞质以渡过饥饿的行为，因此自噬被认为是细胞的一种保护性作用。现研究发现自噬虽然对细胞具有保护作用，但过度的自噬可导致细胞死亡, 而这被认为是区别于细胞凋亡( I 型程序性死亡) 的另外一种细胞程序性死亡形式( II 型程序性死亡)，称为自噬性细胞死亡。肿瘤细胞发生自噬后会出现2种不同的结果: 一种是保护细胞防止周围环境带来的损害; 另一种是启动自噬性细胞死亡程序[8]。目前, 对于这2种不同结果的产生还没有发现特定的规律。如果可以诱导肿瘤细胞产生自噬, 继而引起细胞死亡, 可以消除自噬对肿瘤细胞的保护作用, 将对肿瘤的治疗带来一个新的途径。

CD147是一个分子量为50～60 kD的单次跨膜糖蛋白，属于IgSF成员。CD147在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞中高表达，参与肿瘤的侵袭和转移，以及能量代谢和物质代谢。现研究表明，CD147在肝癌细胞中能够抑制自噬的发生，防止过度自噬导致的细胞死亡，对肿瘤细胞具有保护作用[8]。因此，CD147 被认为是肿瘤发展进程中一个重要的分子。

为了研究CD147在前列腺癌细胞中对自噬作用的影响，我们通过RNAi干扰技术建立的稳定低表达CD147的细胞系。通过EBSS培养细胞建立细胞自噬模型，我们研究发现随着饥饿时间延长，CD147表达逐渐增高，证明CD147参与了细胞自噬的发生。LC3蛋白是酵母自噬相关蛋白8的同源蛋白，在合成后其C 末端即被酵母自噬相关蛋白4蛋白酶切割转变为LC3-Ⅰ并散在分布于细胞质内，当自噬被诱导后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-Ⅱ并始终稳定地锚定于自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变代表了自噬的诱导，且LC3-Ⅱ的水平在某种程度上反映了自噬体的数量[9]。我们通过Western blotting实验证明，在CD147干扰组细胞中LC3-Ⅱ表达增高，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值增加，CD147抑制了饥饿诱导的前列腺癌细胞自噬。本实验通过台盼蓝排斥实验检测了细胞死亡情况，结果表明抑制CD1)47的表达后，在饥饿诱导的自噬模型中细胞死亡数量增加。综上所述， CD147抑制自噬的产生，防止过度自噬导致的肿瘤细胞死亡，对肿瘤细胞具有保护作用。

[1] Kuang YH, Chen X, Su J, et al. RNA interference targeting the CD147 induces apoptosis of multi-drug resistant cancer cells related to XIAP depletion[J]. Cancer Lett, 2009, 276(2):189-195.

[2] Dai JY, Dou KF, Wang CH, et al. The interaction of HAb18G/CD147 with integrin α6β1 and its implications for the invasion potential of human hepatoma cells[J]. BMC Cancer, 2009, 9:337.

[3] Chen Y, Zhang H, Gou X, et al. Upregulation of HAb18G/CD147 in activated human umbilical vein endothelial cells enhances the angiogenesis[J]. Cancer Lett, 2009, 278(1): 113-121.

[4] Le Floch R, Chiche J, Marchiq I, et al.CD147 subunit of lactate/H+symorters MCT1 and hypoxia-inducible MCT4 is critical of energetic and growth of glycolytic tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(40):16663-16668.

[5] Gou XC, Ru Q, Zhang HX, et al. HAb18G/CD147 inhibits starvation-induced autophagy in human hepatoma cell SMMC7721 with an involvement of beclin 1 down-regulation[J]. Cancer Sci, 2009, 100(5):837-843.

[6] 陈艳媛，廖慧娟，张 灵，等. RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立[J]. 吉林医药学院学报, 2012, 36(6):404-406.

[7] Martinet W, De Meyer GR, Herman AG, et al. Amino acid deprivation induces both apoptosis and autophagy in murine C2C12 muscle cells[J]. Biotechnol Lett, 2005， 27(16):1157-1163.

[8] 杜海磊，邱伟华，杨卫平. 细胞自噬与肿瘤[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(2):401-404.

[9] 王 焕，李小毛，刘穗玲，等. RAD001通过诱导自噬提高人子宫内膜癌细胞对紫杉醇的敏感性[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(11):1966-1971.

CD147 affects autophagy of prostate cancer PC-3 cells

FANG Fang1, FENG Chun1, YAO Yang1, MA Xiao-xiao1, WANG Li-guo2

(1ImmunologyDepartmentofJilinMedicalCollege,Jilin132013,China;2AffiliatedHospitalofJilinMedicalCollege,Jilin132011,China.E-mail:urolancet@sina.com)

AIM: To study the autophagy of prostate cancer PC-3 cells induced by CD147invitro. ME-THODS: The method of amino acid starvation to induce autophagy was used. The expression ofCD147 was detected by Western blotting. To study the functional effects of CD147 on autophagy in prostate cancer PC-3 cells, the down-regulation ofCD147 expression was induced by the technique of RNAi. The conversion of autophagic marker protein LC3-I to LC3-II was determined by Western blotting. The cell death after starvation-induced autophagy was analyzed by trypan blue exclusion assay. RESULTS: The CD147 expression gradually increased in starvation-induced autophagy. The down-regulation of CD147 significantly increased the expression of autophagy-related protein LC3-II compared with control group. Meanwhile, the cell death rates increased from (19.3±3.1)% and (22.3±3.5)% in control groups to (38.4±3.1)% in silencing the expression ofCD147 in the PC-3 cells (P<0.05). CONCLUSION: CD147 inhibits starvation-induced autophgy and autophagy death in the prostate cancer PC-3 cells.

Antigens, CD147; PC-3 cells; Autophagy

1000- 4718(2014)12- 2259- 03

2014- 06- 09

2014- 07- 04

国家自然科学基金资助项目(No. 81202031)；吉林省教育厅“十二五”教育技术研究项目(吉教科合字2012第333号)；吉林省科技厅科技发展计划(No.20130101154JC)；吉林省自然科学基金资助项目(No.201015239)吉林省教育厅“十二五”科学技术研究重点项目(No.吉教科合字2013第346号)

R737.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.025

△ 通讯作者 Tel: 0432-64560741； E-mail: urolancet@sina.com