监测蟾蜍动态心电的简便有效方法*

刘 伟， 路 丹， 纪翠宁， 王 雪， 张林霞， 王光耀， 李秀国

(延边大学医学院，吉林 延吉 133002)

监测蟾蜍动态心电的简便有效方法*

刘 伟， 路 丹， 纪翠宁， 王 雪， 张林霞， 王光耀， 李秀国△

(延边大学医学院，吉林 延吉 133002)

目的： 筛选出适于监测无束缚蟾蜍动态心电的导联方式，并分析其实用性。方法: 蟾蜍在麻醉状态下皮下包埋引导电极后，通过BL-420S生物机能实验系统监测了5种导联的动态心电，比较并筛选出能够较好地显示心电波形的导联。利用该导联监测了蟾蜍从人工冬眠中复苏6 h内的动态心电和连续5 d内的心率和心率变异性(heart rate variability, HRV)的日间稳定性，以及冻融处理前后的心率和HRV，以分析其实用性。结果: 5种备选导联中有2种导联能较好显示心电波形。与人工冬眠复苏6 h比较，复苏1 h之内的心率降低，窦性心率RR间期标准差(the standard deviation of normal R-R intervals, SDNN)升高，二者均有显著差异(P<0.05或P<0.01)；2 h到5 h之间的心率和SDNN无显著变化，提示心电在复苏2 h后恢复稳定。冬眠第4天和第5天的2 h和4 h心率较第1天显著减慢(P<0.05或P<0.01)，而SDNN 较第1天显著升高(P<0.05或P<0.01)，提示留置电极的蟾蜍心电在3 d内不会有显著变化。与冷冻前比较，解冻1 h和12 h的心率显著加快(P<0.05)，SDNN显著变小(P<0.05)，表明冻融后蟾蜍心功能下降。结论: 皮下植入电极的方法可有效监测蟾蜍动态心电。

心电图； 心率变异性； 无束缚蟾蜍

作为两栖类动物，蟾蜍的很多生理特性与哺乳动物相似，而被作为实验动物大量地应用于生理和药理学科研和教学中。蟾蜍实验条件简单，价格低廉，更符合现代科学研究倡导的“3R”原则。李秀国等[1]通过比较不同湿度和温度条件下的蟾蜍生理功能后，发现在人工冬眠条件下能够延长蟾蜍存活时间(36 d以上)，并能较好地维持其正常生理功能，为实验室长时间合理利用蟾蜍提供了依据。在医学科研中利用大鼠、小鼠等实验动物描记心电图的方法较多见。监测方式主要有麻醉后皮下插入针状电极测定标准肢体导联[2-3]，或腹腔包埋发射子后无线遥测心电[4]等。前者由于麻醉状态，一定程度影响心脏功能，后者由于价格昂贵，一般实验室开展较困难。利用蟾蜍观察心电图的方法应用也较广泛。现在多监测毁脑毁髓后的蟾蜍心电[5]。该方法由于蟾蜍心脏失去神经支配，不能完全反映生理状态下的心电变化。一些人用无束缚蟾蜍监测心电，但由于电极直接插入四肢皮下，不利于蟾蜍活动，且电极易脱落，从而影响长时间心电监测[6]。本课题拟在蟾蜍皮下结扎包埋电极后，通过观察5种导联心电图，筛选出能够适于描记各心电波形的导联；用选定导联观察人工冬眠复苏蟾蜍6 h内的心率和代表心率变异性(heart rate variation，HRV)的时域指标，5 min窦性心率RR间期标准差(the standard deviation of normal R-R intervals, SDNN)变化趋势及其5 d内的稳定性；比较蟾蜍在冻融前后的心率和HRV，以期探索能够有效监测无束缚蟾蜍动态心电的简便有效方法。

材 料 和 方 法

1 实验材料

蟾蜍雌雄混用，体重50～70 g，延边大学实验动物科提供；BL-420S生物机能实验系统和心电图导联线(四川成都泰盟科技有限公司)；任氏液为标准配方。

2 实验方法

2.1 制作皮下包埋心电图导联线 取长17 cm、直径0.5 mm的铜丝，一端弯成小圆环。取0.7 cm长的8号不锈钢注射针头套到铜丝的圆环端，并钳夹固定，作为引导电极。铜丝其它部分外包PE管，管口两端用胶水密封，以防止液体进入。

2.2 筛选最佳心电图导联 蟾蜍洗净，腹腔注射25% 氨基甲酸乙酯5 mL/kg麻醉，用0.05% 碘伏消毒手术区域，从背部骶髂关节上方开一小口，将5条导联线分别从右耳后腺后，左、右胸骨外上方，剑突下偏左和骶髂关节下方偏左引入到开口处。电极侧固定在相应插入口的皮下，结扎缝合插入口。调整导联线在皮下的位置，避免凸出皮肤或压迫内脏，并在背部出口处捆成一束，将出口结扎缝合。术后将蟾蜍放入盛有少量任氏液的500 mL烧杯中。当从麻醉状态中苏醒，能够自由活动时，参照文献中方法将蟾蜍置于人工冬眠环境(温度、湿度分别为3～5 ℃、75%～85%)中[1]。24 h后，放回室温下，置于屏蔽用铜网上，按表1连接5种导联，通过BL-420S生物机能实验系统监测并比较各导联的动态心电。通过导联1～3比较在类似标准肢体I、II、III导联条件下的心电。通过导联3～5，比较电极置于背部和腹部时，标准II导联心电。在整个实验过程中，仪器均接地，并保持实验室内安静。

表1 备选蟾蜍心电图引导电极连接部位一览表

2.3 人工冬眠复苏对电极留置蟾蜍心电的影响 为了观察人工冬眠复苏对皮下留置电极蟾蜍心电的影响，随机取6只蟾蜍，按表1的导联4行电极留置术并按照上述方法冬眠后，监测复苏6 h内的动态心电图，并参照文献中方法计算0～6 h的心率和SDNN[7]。由于蟾蜍相对安静，很少出现剧烈活动。对于短暂的活动，测定RR间期时，应避开心电图中肌电干扰大的部分进行测定。

2.4 电极留置蟾蜍心电的日间稳定性 为了观察电极留置蟾蜍动态心电的日间稳定性，随机取蟾蜍6只，按表1的导联4行皮下留置电极术后，连续5 d监测蟾蜍复苏4 h内心电，比较各监测日间的复苏2 h和4 h的心率和SDNN，以分析蟾蜍心功能的日间稳定性。在整个过程中，除监测心电时将蟾蜍放置在室温中之外，其它时间均置于人工冬眠环境中。

2.5 冻融对蟾蜍心电的影响 为了观察皮下留置电极蟾蜍的实用性，随机取蟾蜍6只，按表1的导联4皮下植入电极，测定冻融前心电。之后，将蟾蜍在-20 ℃冷冻30 min致冷休克，在38 ℃任氏液解冻约20 min，至蟾蜍苏醒，肢体运动自如，眨眼反射正常时监测蟾蜍动态心电。比较冷冻前和冻融1 h、12 h后蟾蜍心率和SDNN。

3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件分析,数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较用配对资料的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各种心电图导联结果比较

1.1 类似标准肢体I、II、III导联的蟾蜍心电图 按表1中的导联1～3方式连接后，测得的4种动态心电图见图1。从图中可见，导联1的QRS波群较小，且P波和T波不太明显。导联2和3所测得的心电图波形基本相似。其中P波、QRS波群、T波均比较明显，PR间期和QT间期均可见。T波与QRS波群主波方向相反。

Figure 1.ECGs recorded by attaching the electrodes as the limb lead I, II and III. Lead 1, 2 and 3 were connected as in Table 1.

图1 类似标准肢体I、II、III导联条件下的蟾蜍心电图

1.2 背部导联和腹部导联时，标准II导联蟾蜍心电图 采用导联3～5的连接方式，测得的类似标准肢体II导联心电图见图2。3种心电图波形方向相同，其中以导联4，即右侧耳后腺后处放置负极，剑突下偏左为正极时心电图波形最明显。因此，后面研究均在导联4留置电极。

Figure 2.ECGs recorded by attaching the electrodes on ventral or dorsal position in toads. Lead 3, 4 and 5 were connected as in Table 1.

图2 蟾蜍背部或腹部放置引导电极时的心电图

2 人工冬眠复苏对留置电极蟾蜍心电的影响

蟾蜍从人工冬眠状态中复苏6 h内的心率和SDNN变化趋势见表2。与复苏6 h的心率比较，复苏0 h和1 h的心率显著降低(P<0.01)，而2～5 h心率无显著差异。与复苏6 h的SDNN比较，复苏0 h和1 h的SDNN显著降低(P<0.05或P<0.01)，而2～5 h的SDNN无显著差异。提示人工冬眠复苏2 h后，蟾蜍的心电恢复稳定。

表2 人工冬眠复苏蟾蜍心率和SDNN的变化趋势

Table 2.Variation trends of HR and SDNN in the toads recovering from artificial hibernation (Mean±SD.n=6)

Time(h)HR(min-1)SDNN(ms)010.58±2.50**256.35±121.06**124.31±3.01**52.25±25.37*230.67±3.0627.77±8.79332.88±3.2724.39±10.12433.41±4.1823.01±5.59533.58±4.2924.12±5.67634.27±4.8926.18±9.25

TableP<0.05,**P<0.01vs6 h.

3 人工冬眠复苏蟾蜍心率和SDNN的日间稳定性

电极留置蟾蜍连续5 d人工冬眠复苏时，2 h和4 h心率和HRV的日间稳定性见表3。与第1天的2 h和4 h心率比较，第4天和5天的心率下降(P<0.05或P<0.01)，第2天和第3天无显著变化。与第1天 2 h和4 h的 SDNN比较，除了第4天2 h的SDNN之外，第4天和5天的SDNN下降显著(P<0.05或P<0.01)，第2天和第3天的SDNN无显著变化。提示人工冬眠复苏蟾蜍的心电在前3 d无统计学变化。

表3 人工冬眠复苏蟾蜍的心率和SDNN的日间稳定性

Table 3.The day-to-day stability of HR and SDNN in toads recovering from the artificial hibernation (Mean±SD.n=6)

Time(d)2h4hHR(min-1)SDNN(ms)HR(min-1)SDNN(ms)134.90±6.4337.75±10.8639.84±5.8529.22±9.18232.39±4.9040.81±13.9137.85±3.9936.73±10.17333.52±5.0549.36±26.7636.04±3.8840.50±17.63428.85±3.74*55.49±29.6832.13±4.06*50.53±20.77*530.11±4.26*62.82±27.58*33.22±5.69**55.19±27.35**

TableP<0.05,**P<0.01vs1 d.

4 冻融对蟾蜍心率和SDNN的影响

监测冻融前后蟾蜍心率和SDNN结果见表4。解冻1 h心率较冷冻前显著加快(P<0.01)，SDNN显著变小(P<0.05)；解冻12 h心率较冷冻前也显著加快(P<0.05)，SDNN也显著变小(P<0.05)；解冻1 h和12 h的心率和SDNN均无显著差异。表明冻融后蟾蜍心功能明显受损。

表4 冻融对蟾蜍心率和SDNN的影响

Table 4.Effects of freeze-thawing process on HR and HRV in toads (Mean±SD.n=6)

ParameterPre-freezePost-thawing1h12hHR(min-1)19.38±5.0632.29±4.47**28.22±5.76*SDNN(ms)177.72±103.5348.43±10.38*68.45±23.42*

TableP<0.05,**P<0.01vspre-freeze.

讨 论

本实验通过在皮下留置引导电极后，监测了5种导联方式的蟾蜍动态心电。结果发现，以类似标准II或III导联方式测得的心电图波形较类似标准I导联明显。进一步以类似标准II导联模式在腹侧面和背侧面连接心电图导联的负极后发现，3种心电图波形相似。因为在背侧面留置导联线较在腹侧面容易，且对机体损伤小，根据本实验结果，建议右耳后腺后留置负极。将正极连接到剑突下和骶髂关节处时的心电图各波波形均清晰，且以前者的心电图波形幅度更大。这一结果应该与生理状态下蟾蜍心尖偏向腹侧面，导致心电轴偏向腹侧面有关。在心电监测过程中，引导电极有可能会因为蟾蜍的活动发生移位，从而对监测产生一定影响。通过实验发现，如果留置3根导联线，其中负极固定在右侧耳后腺后，正极固定在剑突下和骶髂关节位置，形成3点支撑，可以明显减少电极移动，并可同时监测2个导联的心电，有效防止心电图波形变形对测定结果的影响。

在健康状态下，许多生理系统存在自然易变性。心率在正常情况下也是呈不规则性变化的。HRV是评价心血管和植物神经调节功能，以及生理和心理健康程度可信赖的多功能指标[6]。HRV是通过24 h或更长时程的动态心电资料的一段时间数据获得的。其中最简单可行的时域指标是连续24 h正常SDNN，用来描述RR间期的分散特征。然而，数分钟甚至10 s的短时程心电记录获得的HRV具有同等价值[7]。本实验通过测定连续5 min的SDNN比较了不同处理因素对蟾蜍HRV的影响。

根据李秀国等[1]的研究，人工冬眠能够延长蟾蜍在实验室存放时间。为了监测蟾蜍从冬眠状态中移到室温时蟾蜍心电变化趋势和在室温中保持相对稳定的心电所需时间，本实验将电极留置蟾蜍从人工冬眠中移到室温后，监测了其6 h动态心电。结果发现，冬眠蟾蜍心率和SDNN在复苏2 h后能够处于稳定状态。皮下留置电极手术会对蟾蜍机体造成一定损伤，进而影响机体生理功能。为了观察电极留置术后蟾蜍经人工冬眠后能够维持相对稳定的心电的时间，监测了其连续5 d冬眠处理后的动态心电。结果发现，皮下电极留置蟾蜍的心电在冬眠前3 d之内心率和SDNN无显著变化。

心肌损伤、心功能衰竭可表现为心电异常，心率和HRV的变化[7]。本实验中利用皮下留置电极蟾蜍监测了冻融对蟾蜍心率和SDNN的影响。结果显示，冻融能够使蟾蜍的心率显著加快，SDNN显著变小，能够证实冻融可导致蟾蜍心功能下降。

通过本实验发现，蟾蜍一般比较安静，适于在皮下留置引导电极后长时间观察动态心电。与毁脑毁髓后测得的心电比较，这种方式更能够反映接近生理状态的心电。由于本实验方法能够用简单的设备和材料监测无束缚蟾蜍心电活动，具有简单、有效且经济等优点，对于心脏生理和药理学方面研究可能有较好的应用前景。

[1] 李秀国, 李鸿雁, 李海东, 等. 温度和湿度对蟾蜍生理功能的影响[J]. 四川动物, 2013, 32(5):734-738.

[2] Esmailidehaj M, Mirhosseini SJ, Rezvani ME, et al. Prolonged oral administration of oleuropein might protect heart against aconitine-induced arrhythmia [J]. Iran J Pharm Res, 2012, 11(4):1255-1263.

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Simple and effective method for monitoring ambulatory electrocardiogram in toads

LIU Wei, LU Dan, JI Cui-ning, WANG Xue, ZHANG Lin-xia, WANG Guang-yao, LI Xiu-guo

(CollegeofBasicMedicine,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:lixg@ybu.edu.cn)

AIM: To screen out a suitable lead for monitoring the ambulatory electrocardiogram (ECG) in unrestrained toad, and to investigate its practicability. METHODS: After subcutaneously implanting the electrodes in toads under anaesthesia, the ambulatory ECG of 5 leads were monitored with BL-420S data acquisition and analysis system, and the leads which could well express the waveform in ECG were screened out. The recovery process of the toads from the artificial hibernation within 6 h, the day-to-day stability of the heart rate (HR) and the heart rate variability (HRV) in 5 successive days of hibernation, and the HR and HRV after freeze-thawing process were monitored to determine its practicability. RESULTS: Two out of 5 leads showed better ECG waveforms. Compared with 6 h post hibernation, lowered HR at 0 h and 1 h was observed, and the standard deviation of normal R-R intervals (SDNN) was significantly increased (P<0.05 orP<0.01), but the HR and SDNN from 2 to 5 h showed no significant difference, suggesting that the cardiac function reached the steady state after 2 h recovery. The HR at 2 h and 4 h on day 4 and day 5 decreased significantly compared with that on day 1 (P<0.05 orP<0.01), followed with a significant increase in SDNN (P<0.05 orP<0.01), suggesting that the ECG remained stable within 3 d. The HR increased, while SDNN decreased significantly at 1 h and 12 h post-thawing compared with that at pre-freeze (P<0.05), indicating the damaged cardiac function after freeze-thawing process. CONCLUSION: The method of subcutaneously implanting electrodes is suitable for effectively monitoring the ambulatory ECG in toads.

Electrocardiogram; Heart rate variability; Unrestrained toad

1000- 4718(2014)12- 2300- 05

2014- 06- 24

2014- 07- 24

国家教育部留学回国项目(教外司留609号)；延边大学第六届本科生科研立项基金项目

R33-33； R331.3+8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.034

△通讯作者 Tel: 0433-2435165; E-mail: lixg@ybu.edu.cn