1株野生平菇菌株的采集及其驯化栽培*

胡晓强 ，李 峰 ，赵建选 ，靳荣线

(1.农业部农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081； 2.河南省新乡市农业科学院，河南 新乡 453003)

1株野生平菇菌株的采集及其驯化栽培*

胡晓强1，2，李 峰2，赵建选2，靳荣线2

(1.农业部农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081； 2.河南省新乡市农业科学院，河南 新乡 453003)

采集到1株野生平菇菌株，对其子实体进行了组织分离，测定了菌丝长势及吃料能力，经ITS分子标记技术鉴定为弗罗里达侧耳；经驯化栽培，成功出菇，味道鲜美，对开发利用野生真菌资源具有重要的意义。

弗罗里达侧耳；ITS；人工驯化；野生真菌资源

我国地域辽阔，自然气候条件复杂，生态类型多样，是世界上高度生物多样性的12个国家之一。据科学家估计，地球上有生物约500万种，其中菌物约150万种，我国至少有菌物10万种，其中已知菌物不足1万种[1]。新乡太行山区属于暖温带大陆性季风气候，四季分明，植被种类丰富，具有丰富的野生真菌资源，开展野生资源调查，进一步摸清本地区的野生真菌资源现状，对野生真菌资源的开发及保护将具有巨大意义[2]。

笔者在2011年野外大型真菌资源调查研究中，采集到1株野生平菇菌株，经ITS分子标记技术鉴定为弗罗里达侧耳，其可供食用，并进行了驯化栽培，成功出菇。

1 材料与方法

1.1 野生子实体材料

1.1.1 标本采集

河南省新乡市红旗区新二街街道两侧景观树(洋槐)树杈上，采集到1株野生平菇菌株，对其进行了现场拍照，并成功对子实体进行了组织分离，菌株现保藏于新乡市农科院食用菌研究所菌种室，菌株编号为Pl.o038。

1.1.2 子实体形态特征观察

肉眼观测野生子实体和人工栽培子实体的外表形态，包括菌肉、菌盖、菌褶、生长环境等因素。

1.1.3 菌丝生长势测定

采集到的野生菌株经组织分离后，置于25℃恒温条件下黑暗培养5 d，在距离菌丝尖端1 cm左右位置，挑取菌种块转入新的CPDA培养基上重新活化，记录菌丝满管时间；将已活化的CPDA菌种转入原种培养基，观察菌丝长势，记录菌丝满瓶时间；选择长势较好的原种瓶，将菌种接入栽培培养基，观察菌丝吃料能力及长势，记录菌丝满袋时间。

1.2 培养基质制备

母种培养基：CPDA综合培养基，土豆200 g、蔗糖20 g、硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾2 g、琼脂条20 g，调水至1 L。

原种培养基：麦粒棉籽壳培养基，麦粒预煮30 min～45 min至麦粒无白心，沥出多余水分， 添加预发酵的棉籽壳1%、石膏1%，装瓶，高压灭菌。

栽培培养基：玉米芯50%、棉籽壳46%、钙镁磷肥2%、尿素1%、石灰1%，预发酵3 d后，常压灭菌，熟料栽培。

1.3 栽培管理

挑选长势健壮的原种，接种24袋栽培培养基，接种完成后，置于20℃～25℃培养室避光培养，湿度低于75%。

菌丝长满栽培袋后，移入出菇棚内出菇，出菇棚温度为24℃～35℃，增加空气湿度至85%～95%，刀片在菌袋两侧划出2 cm～3 cm出菇孔，等待出菇。

1.4 rDNA ITS区扩增

1.4.1 DNA提取

按照CTAB法提取菌丝体DNA，经琼脂糖凝胶电泳法检测DNA提取质量，条带单一，亮度均匀，稀释至合适浓度后备用[3，4]。

1.4.2 PCR扩增

采用引物ITS4( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)，以已提取DNA为模板，扩增该平菇菌株的核糖体DNA片段；反应体系为50 μL，包括10 × PCR缓冲液5 μL，25 mmol·L-1MgCl25 μL，引物ITS4(10 μmol·L-1)和ITS5(10 μmol·L-1)各1 μL，10 mmol·L-1dNTPY 2 μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4 μL，基因组DNA 1 μL，双蒸灭菌水补齐至50 μL。PCR反应程序：95℃预变性2 min后，95℃变性1 min，53℃复性1 min，72℃延伸2 min，进行34个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物在1.4%琼脂糖凝胶中电泳分离后，胶回收试剂盒(生工)回收扩增片段[3-5]。

1.4.3 PCR测序

ITS扩增片段经胶回收后送上海生工公司进行双向测序，测序结果经比对拼接后确定最终序列。

2 结果与分析

2.1 子实体形态特征

野生子实体菌盖直径5.3 cm～8.5 cm，表面干枯，有干状龟裂，肉质致密，淡黄色至白色，边缘齿轮状裂痕，菌褶稀疏，直生，菌柄1 cm～4 cm，侧生，基部稍膨大，表面光滑。人工栽培子实体菌盖直径6 cm～11 cm，白色，质地薄、柔软、坚韧，菌柄细，长1 cm～4 cm，菌褶稀疏，侧生，孢子印白色，子实体幼时为灰黑色，菌盖展开后渐为白色，子实体照片见图1。

2.2 菌丝生长势

菌株产量及生长势情况见表1。

表1 菌株产量及生长势

注：+++表示菌丝生长旺盛；++表示菌丝生长稀疏；+表示菌丝萌发；-表示菌丝未萌发。

由表1可见，菌丝体长势旺盛，在CPDA培养基上平均8 d可长满试管，原种瓶培养时间为25 d，栽培袋培养40 d即可满袋，菌丝抗杂菌能力强，没有出现菌袋污染现象。

2.3 出菇特性

在塑料大棚条件下，出菇棚日平均温度28℃，一般菌袋在移入出菇棚后5 d～10 d即可出现原基，原基发生1 d后即可采收第1潮菇。第1潮菇平均每袋产量 0.1 979 kg，生物学效率44%。

2.4 ITS序列

测得的野生菌株ITS序列片段长度为653 bp，并将其与数据库序列比对，确定其为佛罗里达侧耳，见图2。

图2 佛罗里达侧耳序列片段

3 讨论

采集到的野生菌株菌丝体表现出了侧耳属平菇菌丝长势旺盛、抗杂能力强的特性[6]，本驯化栽培试验采用的是先将栽培基质发酵，然后常压灭菌进行熟料栽培，根据其平菇的栽培特性，采用玉米芯发酵料进行出菇还有待进一步试验。

该野生菌株的采集时间为6月份，出菇试验期间最高气温在35℃左右，表明该菌株为高温型或耐高温型菌株，其子实体白色，质柔软坚韧，较生产中采用的高温型平菇(质地脆，易碎)更耐储运，是较好的遗传种质资源。本试验人工栽培成功后，收集了该野生菌株的孢子印，采用杂交手段，将其与生产菌株进行配对杂交，为全面开发驯化野生菌株的潜力做好前期准备。

野生菌种质资源的收集和鉴定是食用菌产业发展的一项基础性研究工作，按照胡清秀[7]关于中国山区菌物资源区的划分，新乡太行山属于暖温带落叶阔叶林山地菌物区，区内植被以落叶阔叶林、阔叶林以栎类为主、针叶林有赤松、黑松、油松等。菌物资源特征以棕灰口蘑、蜜环菌、血红铆钉菇、毛头鬼伞、羊肚菌、褐疣柄牛肝菌为主，开展野生资源调查，对发掘和保护野生食(药)用菌种质资源具有重要意义。

传统的形态学鉴定，由于野生大型真菌子实体受生长环境、生长时期等客观因素的影响较大，形态性状的选取和判断受主观因素影响较大，所以基于形态性状特征对大型真菌进行分类鉴定具有一定的局限性。ITS序列是位于rDNA编码基因18s、5.8s、28s之间的小基因片段，其在生物进化过程中承受的自然选择压力小，能够容忍更多的变异，在绝大多数的真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。ITS序列分析在判断大型真菌的亲缘关系、遗传地位及系统发育方面提供了巨大的便利[8]。

本试验对扩增到的ITS片段进行了测序，通过NCBI数据库的比对，找到其与弗罗里达侧耳的相似度达99%以上，基本可以确定该野生菌株为弗罗里达侧耳。ITS序列分析技术在野生菌株的鉴定方面有着巨大的应用价值。

[1]袁明生，孙佩琼. 中国蕈菌原色图集[M]. 成都：四川科学技术出版社，2007.

[2]李忠民，杜适普，贺德先，等. 三门峡市野生真菌资源调查与生态区划研究[J].河南农业大学学报，2007，41(5)：551-555.

[3]刘伟. 大型真菌菌丝体分离、培养及其rDNA分子鉴定研究[D]. 石河子：石河子大学，2009.

[4]赵杏利，邓晖，牛永春，等. 一种狗尾草病院真菌的鉴定及菌株致病性研究[J]. 菌物学报，2010，29(2)：172-177.

[5]李传华，章炉军，谭琦，等. 野生拟粘小奥德蘑驯化和栽培研究[J]. 食用菌学报，2012，19(3)：45-48.

[6]王呈玉. 中国侧耳属[Pleurotus(Fr.)Kumm.]真菌系统分类学研究[D]. 吉林农业大学.2004.

[7]胡清秀，吴永堂，胡志全. 中国山区菌物资源区划[J]. 中国农业资源与区划，2008，29(4)：39-43.

[8]许峰，刘宇，王守现，等. 一株野生大型真菌的分离与鉴定[J]. 中国农学通报，2012，28(13)：176-179.

Collection and Domesticated Cultivation of a Wild Mushroom Strain

HU Xiao-qiang1，2, LI Feng2, ZHAO Jian-xuan2, JIN Rong-xian2

(1.Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Beijing100081; 2.Institute of Edible Fungi, Henan, Xinxiang Academy of Agricultural science, XinxiangHenan453003)

A wild mushroom strain were collected, and tissue separation were carried out. Its growth potential and digest ability were determinated, and via ITS molecular marker technology appraisal, it belonged to thePleurotusfloridanusstrain. It fruited successfully by domesticated cultivation, and tasted delicious, which had the vital significance for the development and utilization of wild fungus resources.

Pleurotusfloridanusstrain; ITS; Domesticated cultivation; Wild mushroom resource

*项目来源：农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室资助；河南省食用菌产业技术体系(z2010-03-05)。

胡晓强(1984-)，男，助理研究员，主要从事食用菌育种及栽培技术研究。

2014-09-30

S646.1

A

1003-8310(2014)06-0013-03