泽泻汤加味方对高盐高血压大鼠肾脏AQP-2表达的影响

景文莉 王长志 范洪亮 张树峰△

泽泻汤加味方对高盐高血压大鼠肾脏AQP-2表达的影响

景文莉1王长志2范洪亮1张树峰1△

目的 探讨泽泻汤加味方对高盐高血压大鼠肾脏水通道蛋白（AQP）-2表达的影响。方法以8％高盐饲料喂养的方法制备高盐高血压动物模型50只，造模成功后随机分为模型组，西药组，中药高、中、低组，各10只；另选10只普通饲料喂养大鼠为正常组。中药高、中、低组分别给予泽泻汤加味方混悬液16.2、10.8、5.4 g/(kg·d)；西药组给予缬沙坦氢氯噻嗪溶液16.65 mg/(kg·d)；模型组及正常组灌服等体积蒸馏水。均按每天1 mL/100 g灌胃，灌胃4周。于给药1、4、7、14、28 d时测定大鼠收缩压（SBP），并收集24 h尿量。用免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测肾脏AQP-2蛋白和mRNA的表达。结果SBP由高到低依次是：模型组＞中药中组和中药低组＞西药组和中药高组＞正常组，尿量由高到低依次是：西药组和中药高组＞中药中组和中药低组＞模型组＞正常组，中药中组与中药低组间、西药组与中药高组间差异无统计学意义。模型组肾脏AQP-2沿集合管内壁上皮细胞分布的棕黄色颗粒较正常组及中药高、中、低组明显颜色加深而浓厚，分布面积更广泛。除中药低组AQP-2 mRNA的表达水平与模型组差异无统计学意义外，其余各组均低于模型组，高于中药高组（均P＜0.05）。结论泽泻汤加味方可通过抑制AQP-2的高表达使血压降低。

高血压；肾；水通道蛋白质2；大鼠,Wistar；收缩压；高盐；尿量；泽泻汤加味方

高血压是世界公认的最常见的心血管疾病,是极大危害人类健康的常见病和多发病，其发病机制复杂。肾脏可通过对体内细胞外液量的调节而发挥对血压的调节作用，即肾－体液控制。肾－体液控制系统受体内诸多因素影响，其中较为重要的是血管升压素(AVP)和肾素－血管紧张素－醛固酮系统（RAAS）。水通道蛋白-2(AQP-2)是AVP依赖性水通道，现已证明AQP-2是肾脏重吸收水分、浓缩尿液从而调节机体水平衡的关键蛋白，也是一系列肾脏内外涉及水代谢紊乱疾病的分子基础[1]。本研究旨在探讨泽泻汤加味方能否通过影响高盐高血压大鼠肾脏AQP-2的表达来调节机体水平衡，从而达到降压的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄雄性Wistar大鼠100只，平均体质量（170±20）g，SPF级，购自天津市山川红实验动物科技有限公司，动物合格证号：SCXK（津）2009-001。

1.1.2 仪器及试剂 BP-6动物套尾无创血压仪（成都泰盟科技有限公司），代谢笼、Peltier Thermal Cycler-100（MJ RESEARCH，INC），紫外透射反射分析仪（ZF型，上海嘉鹏科技有限公司）；兔抗大鼠AQP-2多克隆抗体、SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）；RNAiso Reagent (Total RNA提取试剂)、TakaRa RNA PCR Kit(AMV)ver.30、DNA Mark Ladder 100 bp[宝生物工程（大连）有限公司）]。

1.1.3 药物 泽泻汤加味方：泽泻21 g、白术9 g、泽兰15 g、石菖蒲15 g（承德医药集团责任有限公司，批号0712002）；缬沙坦氢氯噻嗪片（诺华制药有限公司，批号2044768）。

1.2 方法

1.2.1 高盐高血压动物模型的制备 参考文献[1-2]以8％高盐饲料喂养的方法制备高盐高血压动物模型，并根据预实验结果对其造模方法加以改造。采用完全随机法从100只大鼠中抽取10只为正常组（普通饲料喂养），余90只以8％高盐饲料自然饲养22周，在喂养第18周到22周时进行血压达标筛选。筛选方法：采用套尾无创血压仪测量清醒状态下大鼠的血压值，每3 d测量1次，每次连续测量3遍，收缩压（SBP）均＞140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）为造模成功[3]。共获得造模成功大鼠71只。

1.2.2 分组与给药 采用完全随机法从71只大鼠中抽取50只，分为模型组、缬沙坦氢氯噻嗪组（西药组）、中药泽泻汤加味方高、中、低剂量组（中药高、中、低组），每组10只。配制泽泻汤加味方中药混悬液，根据动物实验方法学，在成人（60～70 kg）和大鼠相同体表面积的条件下，按照人的体质量∶大鼠的体质量=1∶0.018，中药高、中、低组分别给药：16.2、10.8、5.4 g/(kg·d)，其中含生药量分别为0.81、0.54和0.27 g/mL；西药组给予缬沙坦氢氯噻嗪溶液16.65 mg/(kg·d)，将片剂研磨，蒸馏水溶解；模型组及正常组灌服等体积蒸馏水。所有实验大鼠均按1 mL/100 g灌胃，每天灌胃1次，共灌胃4周。除正常组给予普通饲料外，其他组继续给予8％高盐饲料喂养4周。

1.2.3 血压测量、尿量收集 于给药后第1、4、7、14、28天用套尾无创血压仪测定清醒状态下大鼠SBP。将大鼠放于代谢笼之内禁食、禁水，漏斗下方放量杯，收集24 h尿量。

1.2.4 取材 给药4周后，10％水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉，迅速摘取大鼠双肾，然后将1/2肾脏置于10％福尔马林溶液中固定保存（供免疫组化检测），余1/2肾脏用消毒铝箔包好迅速放入液氮中，-80℃冰箱保存，供逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测。

1.2.5 免疫组织化学SABC法检测AQP-2蛋白的表达水平 肾组织石蜡切片，脱蜡至水，3％H2O2封闭，微波修复，再封闭，加一抗、二抗、加SABC、DBA显色、复染、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并摄片。结果判定：肾脏标本主细胞胞膜和胞浆在光学显微镜下出现棕黄色颗粒为阳性。采用MIVNT显微图像分析系统分析，测定阳性表达细胞的胞膜和胞浆的染色情况，每个样本计数10张切片，随机读取5个视野，在同等条件下测量AQP-2阳性面积的百分比[4]。

1.2.6 RT-PCR检测AQP-2 mRNA水平 AQP-2和β-actin引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。用TRIZOL进行组织总RNA提取，对总RNA进行定量；逆转录按试剂盒说明进行；扩增条件：先行95℃预变性5 min，行94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸5 min。以β-actin作为内参照。PCR终产物在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，UVP成像分析系统拍照观察结果。采用Quantity One软件对图像进行灰度分析，每组实验至少重复5次。以AQP-2的目的基因条带与βactin基因条带的灰度比值作为AQP-2的相对表达水平。

Tab.1 AQP-2 and β-actin primer sequences表1 AQP-2、β-actin引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泽泻汤加味方对高盐高血压大鼠血压的影响 （1）组内变化趋势。除正常组不同时点SBP变化不明显外，其他组给药第4天时SBP变化不明显，后逐渐降低，至给药第28天时略有升高。（2）组间比较。大鼠SBP由高到低依次是：模型组＞中药中组和中药低组＞西药组和中药高组＞正常组，中药中组与中药低组、西药组与中药高组间比较差异均无统计学意义，见表2。

Tab.2 Comparison of Systolic pressure of rats in each group表2 各组大鼠SBP比较 （n=10，mmHg，±s）

Tab.2 Comparison of Systolic pressure of rats in each group表2 各组大鼠SBP比较 （n=10，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与模型组比较，c与西药组比较，d与中药高组比较，P＜0.05；表2同

组别正常组模型组西药组中药高组中药中组中药低组F 第1天115.3±2.2 151.4±5.8a122.3±2.0ab128.2±7.3ab138.5±1.1abcd134.4±2.1abcd96.18＊＊第4天113.3±4.8 152.0±4.0a131.0±7.8ab121.6±6.8ab140.6±1.4abcd140.0±1.6abcd79.69＊＊组别正常组模型组西药组中药高组中药中组中药低组F 第7天115.0±3.4 148.6±5.1a126.6±5.4ab127.3±4.1ab136.3±2.2abcd137.7±1.9abcd87.70＊＊第14天114.7±2.5 142.8±4.0a115.7±8.6ab119.7±3.8ab133.6±1.4abcd132.0±1.3abcd69.05＊＊第28天106.3±2.0 145.3±4.2a117.5±2.5ab122.5±2.0ab130.4±0.8abcd139.9±1.4abcd369.06＊＊

2.2 泽泻汤加味方对高盐高血压大鼠尿量的影响 （1）组内变化趋势。正常组及模型组不同时点尿量变化不明显，其他组给药第4天时尿量增加较明显，后基本维持在此水平。（2）组间比较。大鼠尿量由高到低依次是：西药组和中药高组＞中药中组和中药低组＞模型组＞正常组，西药组与中药高组、中药中组与中药低组间比较差异均无统计学意义,见表3。

2.3 AQP-2免疫组化染色结果比较 AQP-2在肾小球和肾间质未见表达，而在肾集合管表达。模型组大鼠肾脏AQP-2沿集合管内壁上皮细胞分布的棕黄色颗粒较正常组明显颜色加深而浓厚，分布面积更广泛。中药高、中、低组AQP-2的棕黄色均较模型组明显色度减轻，面积减少，见图1。正常组、模型组、西药组、中药高组、中药中组、中药低组AQP-2阳性面积的百分比分别为0.019±0.007、0.053±0.005、0.024±0.003、0.020±0.009、0.022± 0.006、0.025±0.002。

2.4 各组AQP-2 mRNA的表达水平比较 除中药低组AQP-2 mRNA的表达水平与模型组差异无统计学意义外，其余各组均低于模型组；各组AQP-2 mRNA的表达水平均高于中药高组（均P＜0.05）。见图2、3。

Tab.3 Comparison of Urine volume of rats in each group表3 各组大鼠尿量比较 （n=10，mL，±s）

Tab.3 Comparison of Urine volume of rats in each group表3 各组大鼠尿量比较 （n=10，mL，±s）

组别正常组模型组西药组中药高组中药中组中药低组F 第1天12.3±0.5 32.1±1.0a54.5±1.3ab48.5±0.9ab42.6±0.7abcd39.1±1.0abcd2 478.34＊＊第4天13.9±0.9 33.3±2.1a57.0±2.3ab51.8±3.4ab43.8±2.0abcd38.5±0.9abcd523.25＊＊组别正常组模型组西药组中药高组中药中组中药低组F 第7天13.7±0.8 32.4±0.7a55.3±1.9ab50.2±2.7ab43.9±1.4abcd38.8±0.7abcd912.05＊＊第14天12.8±0.8 32.9±0.6a55.4±1.0ab51.0±2.8ab44.5±2.0abcd38.8±0.6abcd983.28＊＊第28天13.5±0.7 32.6±0.5a57.0±1.5ab52.1±2.0ab43.3±1.8abcd38.5±0.7abcd1 341.75＊＊

Fig.2 AQP-2mRNA expression results in renal tissue of rats in each group图2 各组大鼠肾组织AQP-2 mRNA的表达结果

Fig.3 AQP-2 mRNA expression in Renal tissue of rats图3 各组AQP-2 mRNA的表达水平比较

3 讨论

有研究认为高血压患者多存在着水浊内蕴、痰湿阻滞、瘀血内停的病理因素；且水浊、痰湿、瘀血相互缠绵，共同作用于疾病的发生、发展，致使本病缠绵不愈、兼症丛生。运用或兼用利水泄浊、祛痰化湿、活血化瘀等在治疗高血压及其并发症以及缓解靶器官的损害等方面，均取得了一定的疗效[4-6]。

泽泻汤加味方是根据中医基础理论及临床经验总结而成的方剂，其特点是通过多途径、多靶点的整体调节，通过利水为主，利水、活血、祛痰三法合一发挥降压作用，具有安全、可靠、不良反应小，可连续、长期服用的特点，旨在将血压能够控制、稳定在一定水平，改善中医证候及生存质量，减少患者对西药的用量及依赖性。

流行病学调查结果显示，人群食盐摄入量越高，高血压流行情况越普遍[7]。高血压时，钠代谢障碍可涉及多个器官，也可导致神经内分泌激素的异常分泌，其中AVP是重要的调节因素[8]。受AVP调控且在肾脏中表达的AQP-2是调节机体水代谢的关键蛋白，肾脏集合管主细胞内的AQP-2的表达、穿梭增加是导致水钠潴留的重要环节。

本研究结果显示，AQP-2在肾脏的集合管表达，而在肾小球和肾间质未见表达，与已往报道一致[9]。模型组AQP-2蛋白和mRNA的表达水平均明显高于正常组。AQP-2有2种调节方式[10]，本研究中AQP-2水平变化的机制是由于钠潴留等一些外周性和中枢性因素致使血浆渗透压、压力负荷及容量负荷发生改变，刺激下丘脑－垂体系统释放AVP与肾小管的V2受体结合，激活腺苷酸环化酶，通过穿梭机制使集合管主细胞内AQP-2发生重新分布，导致管腔侧膜上活性AQP-2数目增加；而在AVP长期作用下，AQP-2本身的合成也可明显增强，表现为其mRNA与蛋白分子表达显著增强，水重吸收增加，此变化与AVP水平增高成正相关[11]。

中药组灌服泽泻汤加味方后，各给药组的血压下降，尿量增加。给药组的AQP-2 mRNA及蛋白水平低于模型组。笔者认为泽泻汤加味方是通过中药组方发挥整体调节作用，通过多靶点、多途径发挥其降压作用，其中以利尿作用为主，加之活血、祛痰。利水可降低AQP-2的表达，而AQP-2是AVP依赖性水通道,二者间呈正比关系；泽泻汤加味方可降低AVP分泌，使肾脏对水的重吸收减少，以减少水潴留，从而使血压恢复到正常水平[12]。

Fig.1 AQP-2 immunohistochemical staining of renal tissue in each group(×40)图1 各组大鼠肾组织AQP-2免疫组化染色结果（×40）

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（2014-03-06收稿 2014-07-14修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effect of Modified Zexie Decoction on Renal Aquaporin-2 Expression in Hypertension Rats Induced by High-Salt

JING Wenli1，WANG Changzhi2，FAN Hongliang1，ZHANG Shufeng1△
1 Chengde Medical University，Chengde 067000,China;2 Hebei Union University College of Traditional Chinese Medicine
△

E-mail：zsf@cdmc.edu.cn

ObjectiveTo explore the effect of modified Zexie Decoction on renal aquaporin-2(AQP2)expression in high-salt hypertensive rat.MethodsHypertensive rats model was established by feeding rat with 8％high salt.Rats(n= 50)were divided into model group,modern medicine group,traditional Chinese medicine groups of high,medium,low dose, with 10 rats in each group.The other 10 rats were fed with ordinary diet as normal group.Rats in traditional Chinese medicine of high,medium,low groups were given Zexie Decoction suspension of 16.2,10.8 and 5.4 g/(kg·d)respectively;Rats in modern medicine group was given Valsartan hydrochlorothiazide 16.65 mg/(kg·d);the model group and normal group was administered with equal volume of distilled water.Animals were feed with medications at 1 mL/100 g by gavage for 4 weeks. On the 1st,4th,7th,14thand,28thday of administration,we measured SBP and collected 24 h urine.We employed immunohistochemistry to detect renal AQP-2 protein expression level and RT-PCR to detect renal AQP-2 mRNA transcription level.ResultsThe rank of SBP from high to low is:model group＞traditional Chinese medicine medium and low dose groups＞traditional Chinese medicine high dose group and western medicine group＞normal group.The rank of urine volume from high to low is:Western medicine group and traditional Chinese medicine high dose group＞traditional Chinese medicine medium and low dose group＞normal group,the difference was not statistically significant between traditional Chinese medicine medium and low dose group,or between western medicine group and traditional Chinese medicine high dose group. The renal AQP-2 in epithelial cells along the collecting duct wall of rats in model group show brown particles which are darker and wider distributed than those in normal group and traditional Chinese medicine of high,medium,low dose groups. RT-PCR results show that AQP-2 mRNA expression is highest in rats of model group and lowest in rats of traditional Chinese medicine high dose group(P＜0.05).No statistical significance of AQP mRNA level was found between traditional Chinese medicine low group and model group(P＜0.05).ConclusionModified Zexie Decoction can lower blood pressure by inhibiting the expression of AQP-2.

hypertension;kidney;aquaporin 2;rats,Wistar;SBP;high salt;urine volume;modified zexie decoction

R544.1，R285

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.012

河北省科学技术支撑项目计划课题(NO.09276101D-20)

1承德医学院（邮编067000）；2河北联合大学中医学院△

E-mail：zsf@cdmc.edu.cn