Th17和Treg细胞来源的儿茶酚胺在胶原诱导性关节炎中的作用

王小琴 彭聿平 刘 展 邱一华

实验研究

Th17和Treg细胞来源的儿茶酚胺在胶原诱导性关节炎中的作用

王小琴 彭聿平 刘 展 邱一华△

目的 探讨胶原诱导性关节炎（CIA）疾病发生发展过程中Th17和Treg细胞来源的儿茶酚胺（CAs）的作用。方法随机将18只雄性DBA/1小鼠分为对照组、CIA模型Ⅰ组（35 d）和CIA模型Ⅱ组（55 d）。Ⅱ型胶原乳剂尾根部注射制备CIA小鼠模型。Real-time PCR法检测淋巴结中Th17细胞的特异性转录因子ROR-γt，相关细胞因子IL-17和IL-22，Treg细胞的特异性转录因子Foxp3，相关细胞因子转化生长因子（TGF）-β以及酪氨酸羟化酶（TH）的mRNA表达。免疫荧光组织化学染色法观察淋巴结中ROR-γt和Foxp3分别与TH、囊泡单胺转运体-2 （VMAT-2）和单胺氧化酶（MAO）的共定位情况。结果与对照组相比，CIA模型Ⅰ组和模型Ⅱ组的小鼠淋巴结中ROR-γ、IL-17、TH和IL-22的mRNA表达增加；Foxp3和TGF-β的mRNA表达减少；其中模型Ⅱ组IL-17的mRNA表达与模型Ⅰ组相比有所降低。对照组和CIA模型Ⅰ组及模型Ⅱ组的小鼠淋巴结中存在ROR-γt和Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO的共定位细胞。CIA模型组小鼠淋巴结中ROR-γt/TH、ROR-γt/VMAT-2和ROR-γt/ MAO双阳性细胞数增加，模型Ⅱ组中的这些双阳性细胞数与模型Ⅰ组相比有所减少。结论CIA模型组小鼠淋巴结中Th17细胞合成CAs的能力增强，这种Th17细胞来源的CAs的增加可能在CIA的发生发展过程有一定的抗炎作用。

关节炎,类风湿；儿茶酚胺类；T淋巴细胞,调节性；酪氨酸单氧化酶；Th17细胞；胶原诱导性关节炎

儿茶酚胺（catecholamines,CAs）一直被认为主要由神经细胞和内分泌细胞合成和分泌。近年来研究发现免疫细胞也能合成CAs[1]。笔者前期研究显示淋巴细胞能够表达合成CAs的限速酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）[2]。淋巴细胞来源的CAs对T淋巴细胞的增殖、凋亡及分化起调节作用[3-5]。类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节慢性滑膜炎为主的自身免疫性疾病[6]。胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis,CIA）是当前研究RA较理想和最为常用的动物模型。虽然RA的发病机制不是十分明确，但有研究表明CD4+T细胞在RA致病机制中具有重要作用[7]。传统观点认为CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞2个细胞亚群。最近的研究发现，Th17和Treg细胞也是CD4+T细胞的2个重要亚群[8]。Th17细胞主要分泌白细胞介素（IL）-17和IL-22，其特异性转录因子是ROR-γt；Treg细胞主要分泌转化生长因子（TGF）-β，其特异性转录因子是Foxp3。RA患者滑膜液及滑膜组织中被发现存在IL-17，Treg细胞作为免疫调节细胞成为RA的治疗措施之一亦有报道[9-10]。笔者最近研究发现，CIA小鼠滑膜组织中CD4+T能够合成CAs，且具有一定的抗炎作用[11]。本研究借助CIA小鼠模型，探讨淋巴组织中Th17和Treg细胞能否合成CAs，以及Th17和Treg细胞来源的CAs在CIA中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SPF级近交系DBA/1小鼠18只,8～10周龄,购于上海斯莱克实验动物有限公司，采用抽签法将动物随机分为正常对照组和CIA模型Ⅰ组（35 d）和CIA模型Ⅱ组（55 d）。

1.2 主要试剂 小鼠抗ROR-γt、Foxp3、囊泡单胺转运体-2 （VMAT-2）和单胺氧化酶（MAO）抗体均购于Santa cruz公司；小鼠抗TH抗体购于Millipore公司；鸡Ⅱ型胶原（collagen Ⅱ,CⅡ）购于Sigma公司；弗氏完全佐剂（CFA）购于Chondrex公司；脂多糖（LPS）购于Sigma公司。FITC羊抗小鼠抗体购自Sigma公司；罗丹明标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 CIA模型制备 等体积CFA与在0.1 mol/L冰醋酸中溶解的CⅡ（2 g/L）混合，充分乳化制成胶原乳剂。在小鼠尾根部多点皮下注射0.1 mL胶原乳剂，初次免疫后21 d在腹腔注射该胶原乳剂0.1 mL加强免疫，28 d腹腔注射LPS 20 μg加速关节炎发生。从加强免疫后开始,每隔2 d对每只小鼠4个足爪进行评分，直至初次免疫后55 d为止。关节炎分级评估：0分，所有的关节无任何红肿；1分，轻度的红和（或）肿；2分，显著的红肿；3分，关节僵硬或运动受限。每只小鼠4个足爪均评分，最高分为12分。

1.4 Real-time PCR法检测mRNA表达 取各组小鼠肠系膜淋巴结，提取RNA。逆转录生成cDNA，再进行实时PCR扩增。引物由Invitrogen生物技术公司合成，序列见表1。PCR反应条件：94℃5 min预变性，95℃20 s，61℃20 s，72℃20 s，循环40次。

Tab.1 The primer sequences表1 引物序列

1.5 免疫荧光组织化学染色 初次免疫后35 d或55 d，对小鼠进行腹腔麻醉后，灌注、固定、取肠系膜淋巴结进行冰冻切片，片厚25 μm,加山羊血清封闭30 min，加入ROR-γt抗体后分别加入TH、VMAT-2或MAO抗体；或者加入Foxp3抗体后分别加入TH、VMAT-2或MAO抗体。4℃孵育过夜，加入FITC标记的羊抗小鼠和罗丹明标记的羊抗兔二抗，室温孵育4 h，PBS漂洗，甘油封片,荧光显微镜下观察。随机读取5个视野进行照相,取5张片子，然后统计所有切片中阳性细胞数总数。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件，各组数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，组间多重比较用采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠淋巴结中Th17和Treg细胞相关基因检测结果 CIA模型组淋巴结中ROR-γt、IL-17及IL-22 mRNA的表达较对照组增高，IL-17 mRNA的表达在CIA模型Ⅱ组较CIA模型Ⅰ组明显降低（均P＜0.05）。ROR-γt和IL-22的表达在2个模型组间差异无统计学意义。CIA模型Ⅰ组淋巴结中Foxp3 mRNA的表达与对照组相比无明显变化，CIA模型Ⅱ组较对照组明显降低。CIA模型组TGF-β的表达与对照组相比显著降低，但2个模型组间差异无统计学意义。CIA模型组TH mRNA表达与对照组相比明显增加，但2个模型组间差异无统计学意义，见表2。

Tab.2 Gene expression level in lymph nodes of mice from each group表2 各组小鼠淋巴结中各基因表达的变化(n=3,±s)

Tab.2 Gene expression level in lymph nodes of mice from each group表2 各组小鼠淋巴结中各基因表达的变化(n=3,±s)

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与CIA模型Ⅰ组比较，P＜0.05

组别对照组CIA模型Ⅰ组CIA模型Ⅱ组F ROR-γt 1 4.53±0.52a3.53±0.50a19.170＊＊IL-17 1 7.89±0.75a4.33±0.95ab72.703＊＊IL-22 1 2.68±0.53a2.26±0.22a20.974＊＊组别对照组CIA模型Ⅰ组CIA模型Ⅱ组F Foxp3 1 0.90±0.05 0.80±0.12a6.028＊TGF-β 1 0.53±0.15a0.74±0.06a18.169＊＊TH 1 1.83±0.19a1.87±0.20a9.211＊

2.2 淋巴结中的 Th17细胞合成、储存和降解CAs 对照组和CIA模型组淋巴结中均有ROR-γt分别与TH、VMAT-2和MAO共定位的双阳性细胞存在，即Th17细胞能够合成、储存、降解CAs，见图1。CIA模型组淋巴结中 ROR-γt/TH、ROR-γt/ VMAT-2、ROR-γt/MAO共定位的双阳性细胞数均多于对照组，且模型Ⅱ组的ROR-γt/TH和ROR-γt/ MAO共定位的双阳性细胞数与模型Ⅰ组相比显著降低（均P＜0.05），见表3。

Tab.3 Number of Double-positive cell in lymph nodes from mice in each group表3 各组小鼠淋巴结中双阳性细胞数（n=3,±s）

Tab.3 Number of Double-positive cell in lymph nodes from mice in each group表3 各组小鼠淋巴结中双阳性细胞数（n=3,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与CIA模型Ⅰ组比较，P＜0.05；表3同

组别对照组CIA模型Ⅰ组CIA模型Ⅱ组F ROR-γt/TH 23.0±3.6 40.3±3.2a33.0±3.0ab21.072＊＊ROR-γt/VMAT-2 30.7±4.5 57.7±10.0a46.0±7.0a9.727＊ROR-γt/MAO 32.3±4.5 61.0±4.4a48.3±5.1ab28.284＊＊

2.3 淋巴结中Treg细胞能够表达TH、VMAT-2和MAO 对照组和CIA模型组淋巴结中均有Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO共定位的双阳性细胞存在，即Treg细胞能够合成、储存、降解CAs，见图2。3组间Foxp3/TH、Foxp3/VMAT-2、Foxp3/MAO共定位的双阳性细胞数比较差异无统计学意义，见表4。

Tab.4 Number of Double-positive cell in lymph nodes of mice from each group表4 各组小鼠淋巴结中双阳性细胞数 （n=3,±s）

Tab.4 Number of Double-positive cell in lymph nodes of mice from each group表4 各组小鼠淋巴结中双阳性细胞数 （n=3,±s）

组别对照组CIA模型Ⅰ组CIA模型Ⅱ组F Foxp3/TH 23.7±3.1 25.7±3.1 25.0±1.0 0.475 Foxp3/VMAT-2 26.3±3.5 31.0±4.6 29.0±4.6 0.908 Foxp3/MAO 30.3±4.2 34.3±4.5 33.0±3.5 0.752

3 讨论

RA以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要特征，是一种可累及全身的慢性炎症性自身免疫性疾病，其病因不是十分明确，与多种因素有关。有学者认为CD4+T细胞在RA的发病机制中有着重要的作用[7]。Th17和Treg细胞是CD4+T细胞中2个重要的亚群。有研究报道，RA患者外周血存在致炎细胞因子/抗炎细胞因子失衡及Th17/Treg的细胞比例失调的现象[12]。本研究中显示CIA模型组小鼠的淋巴结中Th17细胞的ROR-γt mRNA表达增加，而Treg细胞的Foxp3 mRNA表达与对照组相比有所降低，说明CIA模型组淋巴结中存在Th17/ Treg细胞比例失调。此外，CIA模型组小鼠淋巴结中致炎细胞因子IL-17和IL-22 mRNA的表达增加，而抗炎细胞因子TGF-β mRNA表达减少，说明CIA模型组的淋巴结中存在细胞因子/抗炎细胞因子的失衡。这种细胞比例及致炎/抗炎细胞因子的失衡在模型组（55 d）得到一定程度的缓和。

CIA小鼠滑膜组织中的中性粒细胞、B细胞、巨噬细胞均能合成CAs[13]。本研究显示对照组和CIA模型组淋巴结中存在Th17和Treg细胞各自的特异性核转录因子ROR-γt和Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO的共定位细胞，提示CD4+T细胞亚群Th17和Treg细胞均可以合成、储存和降解CAs。本研究中CIA模型组淋巴结中TH表达显著升高，其他实验室的研究亦发现CIA模型组小鼠淋巴结、脾脏和关节中TH+细胞数显著高于对照组[14]。笔者最近的研究表明在CIA模型组小鼠的关节滑膜中CD4+T细胞TH的表达增加[11]。本研究表明CIA模型组淋巴结中Th17细胞合成、储存和降解CAs的能力显著高于对照组，而CIA模型组Treg细胞合成、储存和降解CAs的能力与对照组相比无明显改变，说明CIA模型组淋巴结中增多的TH有部分是来自Th17细胞的作用。有研究报道，过继转移TH+细胞可以减轻CIA小鼠的症状，而6-羟基多巴可以清除TH+细胞，从而逆转上述反应[15]。关节局部注射利血平，可增加关节中细胞内CAs的水平，也可缓解CIA模型组小鼠关节的炎症症状[16]。在CIA模型组小鼠淋巴结中，Th17细胞合成CAs的能力在模型Ⅱ组与模型Ⅰ组相比有所降低，这种现象与CIA中Th17/Treg细胞比例及致炎因子/抗炎因子失衡的缓解相平行。提示Th17细胞产生的CAs可能在CIA发生发展过程中有一定的抗炎作用，具体的作用机制有待进一步研究阐明。

综上，CIA模型组小鼠淋巴结中Th17细胞的致炎效应增强，而Treg的抗炎效应减弱。同时，CIA模型组小鼠淋巴结中TH的表达增加，这种增加有部分是来自Th17细胞的作用。Th17细胞合成CAs的能力与Th17/Treg功能失衡的缓和相平行，提示Th17细胞来源的CAs在CIA发病过程中有抗炎作用。

Fig.1 Co-expression of ROR-γt with TH,VMAT-2 or MAO in Th17 cells(×400)图1 Th17细胞中ROR-γt分别与TH、VMAT-2和MAO共定位的免疫荧光染色图（×400）

Fig.2 Co-expression of Foxp3 with TH,VMAT-2 or MAO in Treg cells(×400)图2 Treg细胞中Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO共定位的免疫荧光染色图（×400）

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（2014-09-09收稿 2014-09-29修回）

（本文编辑 李国琪）

Role of Catecholamines Derived from Th17 and Treg Cells in TypeⅡArthritis Induced by Collagen

WANG Xiaoqin,PENG Yuping,LIU Zhan,QIU Yihua△
Department of Physiology,School of Medicine,Nantong University,Nantong 226001,China
△

E-mail:yhqiu@ntu.edu.cn

ObjectiveTo explore the role of Th17-and Treg-derived catecholamines during collagen-induced arthritis(CIA)progression.MethodsEighteen male DBA/1 mice were randomly divided into control group,CIA model group Ⅰ(day 35)and CIA model groupⅡ(day 55).The CIA models were induced by typeⅡcollagen(CⅡ)injection from tails. mRNA expression of Th17 specific transcription factor include ROR-γt,cytokines,IL-17 IL-22,Treg specific transcription factor,Foxp3,cytokines,TGF-β and tyrosine hydroxylase(TH)in lymph nodes were examined by real-time PCR.Co-localization of ROR-γt or Foxp3,with TH,vesicular monoamine transporter-2(VMAT-2)or monoamine oxidase(MAO)in lymph nodes were observed by immunofluorescence staining.ResultsIn lymph nodes of mice in CIAⅠgroup and CIAⅡgroup, mRNA expression of ROR-γt,IL-17,TH and IL-22 were upregulated,while mRNA expression of Foxp3 and TGF-β expression was downregulated compared to those expression in control group.The upregulated expression of IL-17 was significantly reduced in CIAⅡgroup compared with that in CIAⅠgroup.In the lymph nodes of both intact and CIA mice,co-localization of ROR-γt or Foxp3 with TH,VMAT-2 or MAO was seen in some cells.The numbers of cells that are double-positive of ROR-γt/TH，ROR-γt/VMAT-2 and ROR-γt/MAO IL-17 were increased in CIA groups compared to those in control group.And they are significantly reduced in CIAⅡgroup compared with those in CIAⅠgroup.ConclusionThe ability to synthesize catecholamines in Th17 cells was increased in lymph node in mice from CIA groups compared to that in control group.The increased catecholamines production from Th17 cells in lymph nodes may be involved in the anti-inflammatory progression in CIA.

arthritis,rheumatoid;catecholamines;T-lymphocytes,regulatory;tyrosine 3-monooxygenase;Th17 cells;collagen-induced arthritis

R392

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.006

国家自然科学基金资助项目（31371182）；江苏省高校自然科学研究项目（13KJB310012）

南通大学医学院生理学系（邮编226001）

△通讯作者 E-mail:yhqiu@ntu.edu.cn