小麦秸秆降解菌的筛选及混合发酵

魏 嵬，周 磊，李 峰

（淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000）

中国是农业大国，粮食生产量位居世界前列，然而，随之带来的秸秆产量却高达7.0×108吨［1］.其中，只有很少一部分作为农业肥料使用，绝大多数秸秆都是通过燃烧的方式处理掉，不仅利用率很低、造成能量的流失，而且污染环境、浪费生物质资源［2］.近些年，随着科学技术的发展、全球资源贫乏，生物质能源的充分利用被提上日程，如何将这些木质纤维素转变为可用能源成为研究的热点.

小麦秸秆作为日常生活中常见的秸秆，其主要结构由纤维素、半纤维素和木质素组成，且从它们各自分子组成来看，都可以降解为较易利用的单糖.这三种成分复杂且联系紧密，靠单一的菌种分解往往比较慢，不能得到有效利用.Michele等［3］提出了利用曲霉属真菌使小麦秸秆自动水解方面的应用；刘鹏等［4］从腐殖土壤中分离出能够降解滤纸条的纤维素降解菌；陶树兴等［5］从土壤悬液中分离出能够利用纤维素的固氮芽孢杆菌作为生产生物固氮菌肥料的菌株；向殿军等［6］从土壤中筛选出能够提高玉米秸秆利用率的优质菌种.而在自然界中，秸秆的降解通常是在多种微生物共同作用下完成的［7］，因此本研究先从自然界中筛选出可以独自降解纤维素、半纤维素（主要成分为木聚糖）和木质素的菌种，并做菌种鉴定和不同因素对还原糖产量的影响，并期望得到最佳的培养条件.

1 材料与方法

1.1 采样

本校附近的村庄采集的牛粪、本校旧操场北面草地、逸夫楼周围树林和菜园表层2-12 cm土壤.

1.2 培养基

（1）纤维素培养基

CMC-Na 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，刚果红 0.4 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL pH7.0.

（2）木聚糖培养基

K2HPO41.0 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，（NH4）2SO42 g，木聚糖10 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0.

（3）PDA 培养基

马铃薯100 g，琼脂5-10 g，蒸馏水500 mL，葡萄糖10 g，自然pH蒸煮30 min后用3层纱布过滤取其汁液.

（4）DNS试剂的配制

将18.2 g 酒石酸钾钠，溶于50 mL 蒸馏水中，加热后再依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至100 mL，贮于棕色瓶中，室温保存.

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的筛选

实验采用浓度梯度稀释平板法来筛选上述菌株.分别取上述10 g样品土壤置于烧杯中，加入90 mL蒸馏水制成样品溶液.充分混匀后，取出1 mL样品上层溶液加入另一支事先加入9 mL蒸馏水的试管中，以此类推稀释样品溶液105倍.然后取稀释105倍的样品溶液100 μL分别涂布于各种筛选培养基上，用涂布棒涂布均匀，每个样品涂布3-5个平板.30 ℃恒温箱中培养2 h后，待平板上菌液被培养基吸收后，将平板倒置并继续培养3-4 d.

1.3.2 混合菌的还原糖产量测定

通过显微镜计数板，将上述3种菌体分别制成5×107个/ mL的孢子悬浮液，装液量为20%，每瓶基础发酵培养液加入孢子悬浮液各1 mL，在30 ℃、180 r/min的转速下摇床培养.本实验设对照并做3次重复试验取平均值测其所含还原糖量，并通过正交实验，测出3种降解糖类的菌株及蛋白胨和MgSO4·7H2O对产还原糖量的影响，从而对降解小麦秸秆的能力做出相关分析.

利用DNS方法测定酶活力，首先取1 mL发酵液加入到1.5 mL的离心管中，在4℃、6 500 r/min条件下离心15 min，然后取其上清液作为粗酶液.另取一支20 mL 的试管，依次加入0.5 mL 的粗酶液、0.5 mL1%的木聚糖标准溶液、DNS溶液2 mL，放在50 ℃恒温水浴锅内反应30 min，冷却，用pH7.6的缓冲溶液定容至20 mL，并测其在540 nm 波长的吸光值.另外取一支20 mL 的试管加入1 mL 发酵液、0.5 mL1%的木聚糖标准溶液、DNS溶液2 mL，放在50 ℃恒温水浴锅内反应30 min，冷却，用pH7.6的缓冲溶液定容至20 mL作为对照.

2 结果

2.1 纤维素降解菌的筛选

通过上述实验方法，最终分离出一株能够降解纤维素的菌株，命名为“wl-x”.其单菌落形态呈圆形，菌落直径约20 mm，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，布满一层孢子，菌落背面为青色.在400倍光学显微镜下观察，可以看到：其菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形，不对称分枝，排列紧密，呈扫帚状，其顶端着生5-10个短小瓶状小梗，呈不分枝的链状，初步鉴定为青霉属（Penicilliumsp.）.

图1 wl-x在刚果红培养基上48 h和72 h菌落形态Figure 1 The colony morphology of wl-y in Congo red medium for 48 h and 72 h

2.2 木聚糖降解菌的筛选

从样品中筛选出一株能够分解木聚糖的菌株，并命名为“wl-y”，菌株在木聚糖培养基上生长48 h后，其透明圈半径达到8 mm.将其在PDA培养基上生长72 h后观察，菌落直径可达到2 cm，边缘呈白色，中间呈淡黄色，光学显微镜下发现其菌丝的末端形成球状膨胀，且具有分生孢子，初步鉴定菌株“wl-y”为曲霉属的一株（Aspergillussp.）.

图2 wl-y在刚果红培养基上48 h菌落形态Figure 2 The colony morphology of wl-y in Congo red medium for 48 h

表1 L16（45）正交Table 1 Orthogonal table for L16（45）

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal test

表3 均值响应Table3：The mean response meter

2.3 木质素降解菌

本次试验所用的黄孢原平毛革菌，是一种降解能力很强的白腐真菌，其编号为：CICC40719，来自本微生物实验室.它属于非褶菌目、伏革科、显革菌属.菌丝体为多核，一孢内随机分布多达15个细胞核，菌丝一般无隔膜，也无锁状联合；分生孢子为异核体，担孢子是同核体且交配系统有同宗配合和异宗配合两种形式.在自然界中，它们侵入木质细胞腔内，释放降解木质素和其它木质组分（纤维素、半纤维素、果胶质）的酶，导致木质腐烂成白色海绵状团块，黄孢原平毛革菌亦具有降解木聚糖的能力.

将黄孢原平革菌接种于PDA培养基上，30 ℃恒温培养48 h后观察菌落生长情况：黄孢原毛平革菌的孢子会长满整个平板，呈乳白色.菌落之间连成一片平铺整个平板，没有一点一点空隙.实验证明黄孢原毛平革菌在30 ℃恒温培养时菌落生长情况最好，温度过高或过低都会阻碍此菌的生长.

2.4 混合发酵小麦秸秆产还原糖研究

为了更深一步研究蛋白胨量和Mg2+浓度量对还原糖产量的影响，同时研究这三种菌接种量不一样时对还原糖产量的影响，以wl-x 接种量、wl-y 接种量、CICC40719接种量、蛋白胨量和Mg2+浓度5个因素做L16（45）正交试验.3次试验，并用Minitab 15.1软件对结果进行分析（见表1，表2和表3）.

以上表格及正交试验数据经软件分析得出：（A）wl-x、（B）wl-y、（C）CICC40719的接种量、（D）蛋白胨添加量、（E）MgSO4·7H2O的加入量对混合菌产还原糖量的影响大小顺序为：B＞A＞C＞E＞D.即实验中所筛选出的木聚糖降解菌“wl-y”在还原小麦秸秆时发挥主要作用，其次是分离出的纤维素降解菌和黄孢原平毛革菌.由于小麦秸秆的组成部分主要由纤维素、木聚糖（半纤维素）和木质素构成，而以上3种菌恰好为降解这3种糖类的菌株，所以在产还原糖量的实验中得到充分的证明，从而也验证实验的准确性.

因素、水平最佳组合为：A2、B1、C2、D4、E3.综合以上结果：产还原糖量最高时，50 mL基础发酵培养加入wl-x和CICC40719菌株孢子悬浮液各1 mL，加入wl-y菌株孢子悬浮液0.5 mL，加入蛋白胨0.15 g、MgSO4·7H2O 0.06 g时效果最佳.

3 小结与讨论

本文以小麦秸秆的结构出发，从周围自然界中筛选可以降解纤维素、木聚糖（半纤维素）和木质素的菌种，并将其混合培养研究对秸秆降解的能力.实验从对产还原糖量多少的角度进行比较，得出实验中的三种菌株及蛋白胨添加量与MgSO4·7H2O对小麦降解能力的影响.通过实验，本文从土壤等样品中成功筛选出一株青霉“wl-x”和一株曲霉“wl-y”.“wl-x”具有降解纤维素的能力，在PDA培养基上生长48 h后观察，菌落形态呈圆形，菌落直径约20 mm，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，布满一层孢子，菌落背面为青色.而另一株“wl-y”具有降解木聚糖的能力，“wl-y”在PDA 培养基上生长72 h时，菌落直径可达到2 cm，边缘呈白色，中间呈淡黄色，光学显微镜下观察其菌丝的末端形成球状膨胀，具分生孢子.通过实验进一步验证这两种菌株分别为青霉属（Penicilliumsp.）和曲霉属（Aspergillussp.）.为了获得高效降解小麦秸秆的混合菌群、解决秸秆类固废污染和秸秆资源有效利用的问题，通过用“wl-x”、“wl-y”和“CICC40719”3种菌做混合发酵产还原糖实验，并根据有关表格及正交试验数据和相关软件分析得出结果，表明其影响大小顺序为：“wl-y”接种量＞“wl-x”接种量＞“CICC40719”接种量＞Mg2+浓度＞蛋白胨加入量.从其各自对小麦秸秆降解的影响来看，小麦的主要成分为纤维素、木聚糖（半纤维素）和木质素构成，而能够降解这三类糖类的菌株恰好为实验分离出的两类菌株和实验室保存的能够降解木质素的菌株，充分验证实验的结果与主要降解小麦秸秆因素的一致性.

目前国内对秸秆降解菌的研究工作多集中在从自然界中筛选合适的菌种.对菌种进行鉴定及酶活力研究，然后研究秸秆发酵产乙醇，借以达到缓解能源危机的现状.而本文着手于工农业生产现状，致力于将秸秆发酵产还原糖的研究，弥补国内这方面的研究不足，发酵秸秆采用的是混合菌种，这也为混合菌种降解秸秆技术提供参考.

［1］中央农业广播电视学校.农作物秸秆综合利用技术［M］.北京：中国农业大学出版社，2007.

［2］武峥，张迎君，周心智.降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件研究［J］.纤维素科学与技术，2009，17（2）：20-26.

［3］MICHELE M，MARIA LT，POLIZELI M，et al.Xylanase and ß-xylosidase production by aspergillus ochraceus：new per⁃spective for the application of wheat straw autohydrosisliquor［J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，166：336-347.

［4］刘鹏，姜红霞，鲍正宗，等.一株纤维素降解菌的鉴定及产酶活力测定［J］.蚕业科学，2014，40（1）：97-102.

［5］陶树兴，郭贤，梁健，等.纤维素降解固氮芽孢杆菌的筛选和鉴定［J］.陕西师范大学学报，2014，42（1）：65-69.

［6］向殿军，满丽莉，张春凤，等.玉米秸秆纤维素降解菌的分离及发酵条件优化［J］.安徽农业科学 2014，42（4）：1159-1161.

［7］SANDERSON K.U S biofuels：A field in ferment［J］.Nature，2006（444）：673-676.