不同运动方式对小鼠骨骼肌肌萎缩相关因子表达的影响

陈彩珍，卢 健，季 浏

（1.华东师范大学青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，上海200241；2.华东师范大学体育与健康学院，上海200241）

◄运动人体科学

不同运动方式对小鼠骨骼肌肌萎缩相关因子表达的影响

陈彩珍1，2，卢 健1，2，季 浏1，2

（1.华东师范大学青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，上海200241；2.华东师范大学体育与健康学院，上海200241）

目的：运动能够引起骨骼肌肥大，防止肌萎缩的发生。骨骼肌在萎缩状态下泛素蛋白酶通路被激活，旨在通过检测蛋白降解途径中几个关键因子mRNA的表达，探讨不同的运动形式对抗骨骼肌萎缩的效果及机制。方法：选取21只雄性老年SAMP8小鼠，随机分为对照组（C）、耐力训练组（E）、抗阻训练组（R）。经过8周的训练后，检测小鼠右侧腓肠肌横截面积及MuRF-1、MAFbx、Caspase-3和IGF-1mRNA表达。结果：耐力训练和抗阻训练大鼠腓肠肌MuRF-1、MAFbx和Caspase-3 mRNA表达均显著高于对照组，但两训练组间无显著性差异；IGF-1mRNA的表达两训练组亦显著高于对照组，且抗阻训练组显著高于耐力训练组，抗阻训练组的腓肠肌纤维面积显著高于对照组和耐力训练组。结论：抗阻训练在维持肌质量方面效果优于耐力训练。两种不同的运动方式对腓肠肌质量影响之差异可能不仅仅是通过泛素蛋白酶体途径实现，还与IGF-1介导的骨骼肌再生有关。

肌萎缩；泛素蛋白酶体途径；IGF-1；MuRF-1；MAFbx；Caspase-3；耐力训练；抗阻训练

老年性肌肉萎缩是衰老过程出现的一种退行性变化，严重影响老年人的生活质量，也是一些慢性疾病的诱发原因，但改善肌肉质量一直得不到重视。除了营养物质的改善之外，运动或机械刺激是改善骨骼肌功能的最主要方式。运动能够引起骨骼肌肥大，预防肌萎缩的发生。运动引起骨骼肌肥大的机制已有近百年的研究历史，并且一直是备受运动医学界关注的热点课题。机制虽未阐明，但有研究表明在肌萎缩中存在蛋白质代谢失衡，这与肌肉内泛素-蛋白酶体有密切关系［1-3］。在这一过程中泛素连接酶MAFbx和MuRF1是关键环节［4］，它们结合并介导特异性底物的泛素化。在各种肌萎缩模型中，MAFbx和MuRF1表达上调［5］。运动训练能否通过影响泛素蛋白酶体相关因子的表达、减少蛋白质的分解来达到延缓肌肉衰减的目的，且何种运动方式延缓肌肉衰减的效果更好，目前尚鲜见报道。为此本实验研究长期的抗阻训练和耐力训练对老年小鼠蛋白降解过程中关键因子MuRF-1、MAFbx、Caspase-3 mRNA表达变化的影响，以探寻运动训练改善肌质量的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

6月龄SAMP8小鼠21只，购自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心（实验动物饲养许可证编号：W-J津实动质M准字第006号）。随机分为3组，分别为对照组（C）、耐力训练组（E）、抗阻训练组（R）、每组7只。在IVC独立送风饲养系统中分笼饲养，每日自由饮水，喂食标准饲料，12 h光照，饲养环境温度（22±2）℃，湿度40%～60%。

1.2 运动方案

耐力运动：8周跑台训练。抗阻运动：尾部负重爬梯训练，爬梯为1 m高，每级梯阶间隔1.5 cm，倾斜85°。训练时小鼠被放置于爬梯装置的底部，进行爬梯训练。具体训练方案见表1。

表1 8周渐增强度耐力、抗阻运动训练方案

1.3 主要试剂和仪器

试剂：TRIzol Reagent，M-MLV反转录酶（Invitrogen公司），Goldview（上海赛百盛），Loading bueffer（天根生化科技有限公司），RNA酶抑制剂，Oligo dT15 primer，dNTP Mix（TaKaRa），Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）

仪器：IVC独立送风饲养系统（杭州绍丰公司），立式高速冷冻离心机（Beckman），Step One Real-time PCR仪（ABI），水平／垂直电泳槽，稳压电泳仪，PCR仪（Bio-Rad），凝胶成像系统（Alpha Innotech），石蜡包埋机、冰冻切片机、石蜡烤片机（LEICA）。

1.4 样本的采集

末次运动后24 h，将实验鼠称重，断头处死。迅速取小鼠右侧腓肠肌，经预冷PBS缓冲液冲洗干净，称重，分为3部分（锡纸包裹），腓肠肌中部置入新鲜配置的10%甲醛中固定备石蜡切片，剩余部分暂置液氮保存后放置-80℃超低温冰箱中待RT-PCR检测。

1.5 骨骼肌纤维横截面积的测量

腓肠肌固定后，经脱水、透明、浸蜡、包埋后常规制作厚6μm的石蜡切片，采用苏木精伊红法进行染色并拍照，Leica Qwin软件统计肌纤维横截面积、直径。

1.6 样品RNA的抽提及总RNA的质量和纯度检测

Trizol法提取样本总RNA，经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，显示清晰的28 S、18 S、5 s条带（图1所示），核酸蛋白紫外分析仪检测RNA A260／A280＞1.8，提示总RNA完整性和质量较好。

图1 RNA琼脂糖凝胶电泳

1.7 逆转录

反应体系的总体积为20μl，DEPC水8μl，RNA酶抑制剂（50 U／μl）0.5μl，随机引物（50 pM／ul）2 μl，RNA 2μg，65℃水浴处理5 min，室温放置10 min，高速（高于5 000 g）离心5 s。继续加入反应物：RNA酶抑制剂（50 U／μl）0.5μl，5 xbuffer 4μl，dNTPMIX（1 omM／each）2μl，DTT 2μl，M-MLV（200 Uu／l）1μl。37℃水浴1 h，90℃处理5～10 min，冰浴5 min，高速（高于5 000 g）离心5 s。

1.8 引物设计与合成

通过genebank查到大鼠MuRF-1 mRNA、MAFbx mRNA和Caspase-3 mRNA序列，用Primer Express 3.0自行设计引物序列，由上海捷瑞生物有限公司合成（表2）。用β-actin作为“管家基因”（house keeping gene），用以监控总RNA使用量，以消除不同样本间加样误差。

表2 检测基因的引物序列及RT-PCR反应条件

1.9 荧光定量RT-PCR检测

按照SYBRⓇGreen Premix Kit说明书配制反应体系，反应条件为：预变性95℃3 min；45个循环（95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s），95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s。

1.10 统计学分析

所有数据均以Mean±SD表示。采用SPSS统计软件（SPSS11.5 for Windows）处理，单因素方差分析。以P＜0.05为差异显著性标准，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 训练前后各组小鼠体重比较

实验前后各组小鼠体重组间无显著性差异（P＞0.05）；训练后各组小鼠体重相对于训练前有下降趋势，但无显著性差异（P＞0.05）（表3）。

表3 训练前后各组SAMP8小鼠的体重比较

2.2 小鼠腓肠肌肌湿重体重比及肌纤维横截面积检测

由表4可见，抗阻训练组腓肠肌湿重／体重比值（RM）极显著高于对照组，（P＜0.01），亦显著高于耐力训练组（P＜0.05）。与对照组比较，抗阻训练组小鼠腓肠肌肌纤维横截面积有极显著性增大（P＜0.01）；抗阻训练组亦显著高于耐力训练组（P＜0.05）。

2.3 运动对小鼠腓肠肌MAFbx、MuRF-1 mRNA表达的影响

由表5可见，与对照组比较，耐力训练和抗阻训练组小鼠腓肠肌MAFbx mRNA的表达呈显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。2个训练组MuRF-1 mRNA的表达水平亦明显低于对照组，具有极显著性差异（P＜0.01）。

表4 小鼠腓肠肌肌湿重体重比（RM）及肌纤维横截面积（CSA）

图2 各组小鼠腓肠肌纤维横截面积照片（×40）

表5 小鼠腓肠肌MAFbx、MuRF-1 m RNA的表达

2.4 运动对小鼠腓肠肌Caspase-3和IGF-ImRNA表达的影响

由表6可见，耐力训练和抗阻训练组小鼠骨骼肌Caspase-3 mRNA的表达水平明显低于对照组（P＜0.01，P＜0.05）；而IGF-ImRNA的表达明显高于对照组（P＜0.05，P＜0.01），两训练组之间比较，抗阻训练组IGF-ImRNA水平显著高于耐力组。

表6 小鼠腓肠肌Caspase-3、IGF-Im RNA的表达

3 讨论

衰老过程中肌质量和力量的渐进性下降（sarcopenia）严重影响老年人的生活质量，增加致病率和致死率。骨骼肌质量的维持取决于蛋白质合成和降解的平衡。因此，sarcopenia可能是由于复杂的多因素的影响下肌肉蛋白合成降低，或肌肉蛋白降解程度增强，或者两者兼而有之的持续的变化过程［6］。肌肉蛋白质降解有两条主要途径，即泛素蛋白酶体途径（ubiquit proteasome system，UPs）和溶酶体自噬途径［2］。其中泛素蛋白酶体途径是一种ATP依赖的非溶酶体蛋白降解途径，可高效并高度选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是短寿命的功能蛋白，应激状态下也降解细胞内结构蛋白。整个体系包括泛素分子对底物的识别、靶蛋白的降解等步骤。它是肌原纤维蛋白溶解的最主要方式，最近研究发现泛素蛋白连接酶肌环指蛋白1（MuRF1）、肌萎缩F-box（MAFbx）是其中的关键环节［7］。它们特异性地在心肌和骨骼肌中表达，并在多种肌萎缩模型中表达增强。MuRF1过度表达后，可以破坏titin与其结合的部位，提示MuRF1能调节这一结构蛋白的稳定性［8］。与野生型小鼠比较，MAFbx-／-或MuRF1 -／-小鼠在肌肉失神经后表现出对抗肌萎缩。这些研究显示MAFbx和MuRF-1的表达是泛素蛋白酶体途径致肌萎缩的敏感且可信的标志物。在细胞培养或啮齿类动物的研究中均发现MAFbx和MuRF-1的转录调节是受IGF-1／Akt信号途径控制的［9］。然而，人们对衰老过程中肌纤维泛素蛋白酶途径介导的蛋白降解调节机制所知仍有限，并有争议。如有报道在衰老过程中编码泛素蛋白酶体系组分的mRNA水平无显著升高，蛋白酶体特异性活性甚至减弱［10］。而Cai等人发现在衰老啮齿动物和人快肌中泛素蛋白水平大幅提高［11］。因此，泛素蛋白酶途径在衰老过程中是被抑制还是被激活仍不清楚。

运动训练能够增加骨骼肌的质量和力量，改善与肌萎缩相关的细胞和分子水平的变化。运动训练作为一种重要的肌肉衰减防治机制被广泛应用，但是其肌萎缩防治的确切机制仍不明确。不同形式的运动如有助于提高心肺机能的耐力运动和有助于改善肌肉功能的抗阻运动在延缓sarcopenia的发生发展方面效果如何？弄清其机制对于改善老年机体的机能有实质性意义。

本研究通过对老年SAMP8小鼠进行为期8周的训练，发现耐力训练鼠腓肠肌肌纤维横截面积较对照组有增大的趋势，但无显著性差异；而抗阻训练鼠肌纤维横截面积明显大于耐力训练组和对照组，有显著性差异。Yarasheski等通过对老年人进行6个月的不同强度的抗阻训练后发现，抗阻训练能够减少氧化应激，并提供一个潜在的预防细胞老化和sarcopenia的保护性效果。抗阻训练能够逆转在衰老过程中骨骼肌总蛋白的转换［12］。Zoltan等对SD大鼠进行6个月的跑台训练，青年鼠与老年鼠以相同的速度每天训练1 h，每周5天，训练6个月后发现，训练并没有改变青年鼠腓肠肌和跖肌的质量。而24月龄的老年运动组和对照组骨骼肌质量丢失分别为16%和19%。这一结果提示，每天1 h有规律的耐力运动并不能阻止衰老过程中骨骼肌质量的丢失，但可以延缓或者减小肌肉丢失的速率［13］。显然，在改善肌肉体积和质量方面抗阻训练有其突出的优势。

本研究进一步观察了8周耐力训练和抗阻训练鼠腓肠肌MAFbx和MuRF-1的转录水平，发现其mRNA的表达明显下调，但两个训练组之间无显著性差异（P＞0.05）。似乎这两种不同的运动方式对腓肠肌质量影响之差异并不是通过泛素蛋白酶体途径实现的。而Chen等报道8周耐力训练抗肌肉萎缩的效果可能是通过抑制氧化应激诱导的MURF-1表达，阻止MURF-1介导的MHC（肌球蛋白重链）降解来实现的［14］。为了进一步探寻原因，本研究观察了UPS上游的蛋白水解酶Caspase-3，发现耐力训练和抗阻训练小鼠Caspase-3mRNA的表达变化趋势与MAFbx和MuRF-1的一致，即在两种不同的训练方式中Caspase-3的转录水平较对照组明显下调，两训练组间亦无显著性差异。提示抗阻训练有效增大肌肉的体积并不是由于蛋白水解减少导致的，而可能是通过蛋白合成的增强。当然，不管是抗阻训练还是耐力训练均能通过Caspase-3、MAFbx和MuRF-1的转录下调减缓骨骼肌质量随增龄的丢失，不过抗阻训练还通过蛋白合成的增强而更倾向于正平衡。

有研究证实IGF-1通过Akt的活化而下调MAFbx和MuRF-1的表达［9］。在衰老鼠骨骼肌中IGF-1mRNA和活化的Akt均处于较低的水平从而解除对MAFbx和MuRF-1的抑制。另有研究发现MAFbx能促进蛋白酶体对MyoD（肌分化因子）的降解，MAFbx在成肌细胞中的过表达可抑制肌管的形成［15］。因此推测MAFbx的表达上调通过加强MyoD的降解参与了衰老过程中骨骼肌发生的下降及再生能力的下降。这可能是引起Sarcopenia的原因之一。Musaro亦发现骨骼肌IGF-1的过表达有利于保存肌质量和再生潜能［16］。本研究亦观察了耐力训练和抗阻训练对小鼠腓肠肌IGF-1mRNA表达的影响，发现8周训练后，无论是耐力训练组还是抗阻训练组腓肠肌IGF-ImRNA的表达均有显著性增加，且抗阻训练组增加幅度更大，表明IGF-I在抗阻训练导致的腓肠肌肥大中有着更敏感的应答反应。

4 小结

肌质量的维持靠分解和合成因子的平衡。IGF-1通过相关信号转导通路抑制MAFbx和MuRF-1的表达，控制Caspase-3及UPS途径相关组分的转录活性。抗阻训练和耐力训练均能在一定程度上上调IGF-1基因表达，下调Caspase-3、MAFbx和MuRF-1mRNA表达，延缓Sarcopenia的发生或发展进程。抗阻训练在维持肌质量方面效果优于耐力训练。具体机制有待进一步研究。

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责任编辑：郭长寿

Effects of Different Form s of Exercise on Expressions of M uscle Atrophy Related Factors in Gastrocnem ius of M ice

CHEN Caizhen1，2，LU Jian1，2，JILiu1，2
（1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention，M inistry of
Education，East China Normal University，Shanghai200241，China；2.College of Physical Education and Health，East China Normal University，Shanghai200241，China）

Objective：Exercise can lead to skeletal muscle hypertrophy preventing atrophy.Proteolytic events involve the ubiquitination and subsequent degradation of proteinsmarked by E3 ligases.The studyis to exam ine the influence of endurance training and resistance training on the expression of MuRF-1，MAFbx，Caspase-3 and IGF-1mRNA in gastrocnem ius muscle.Methods：21 SAMP8 senile male m ice were random ly distributed into three groups：sedentary（CON，n＝7），endurance training group（n＝7）），resistance training groups（n＝7）.A fter 8wk training，gastrocnem iusmuscles were excised，Muscle-wetweight and bodymass（BM）wereweighed and analyzed by real-time PCR.Results：The ratio ofmuscle wetweight and BM（RM）of resistance training group showed significant differences when compared w ith that of endurance group or controlgroup，8wk endurance training or resistance training resulted in a decrease inmRNA levels of MuRF-1，MAFbx，Caspase-3，whereas two training groups have no significant difference，IGF-1mRNA in two training groupswas significantly higher than that in sedentary，and it is also higher in resistance group than endurance group.Conclusion：Resistance training is better than endurance training inmaintainingmuscle quality effect.Two differentmovementsm ight not be through the samemechanism to influence gastrocnemius quality，and IGF-1 represent potentialmediators implicated in the regulation of MuRF1 and atrogin-1 genes during exercise.

muscle atrophy；ubiquit proteasome system；IGF-1；MuRF-1；MAFbx；Caspase-3；endurance training；resistance training

G804.55

：A

：1004-0560（2014）05-0085-05

2014-06-23；

2014-07-15

“青少年健康评价与运动干预”教育部重点实验室建设项目（40500-541235-14203／004）。

陈彩珍（1967—），女，教授，博士，主要研究方向为运动训练的生物学适应。