猪葡萄球菌脱落毒素Exh C基因的克隆及原核表达

张乐宜，吴坚文，蔡汝健，李 艳，蒋智勇，刘燕玲，宋长绪

（广东省农业科学院动物卫生研究所／广东省兽医公共卫生公共实验室，广东 广州 510640）

猪葡萄球菌 （Staphylococcus hyicus）是葡萄球菌属的一个成员，为革兰阳性球菌，在猪、家禽以及患有乳房炎的奶牛和绵羊的乳汁中都可分离到此菌。该菌在临床上可以引起猪群发生严重的高度接触性渗出性皮炎（Exudative epidermitis，EE）症状。本病主要感染5d～6d的初生哺乳仔猪或刚断奶的仔猪，猪群感染后可造成大批哺乳仔猪或断奶仔猪的死亡[1]。该菌也可引起母猪乳房感染。

表皮脱落毒素是葡萄球菌的主要致病因子之一[2]。Andresen P等[3]对猪葡萄球菌分泌的表皮脱落毒素进行了ELISA和Western blot分析，结果表明它是一种外毒素，为一种热不稳定蛋白，分子质量大小约为30ku；同时将发现的4种脱落毒素类型分别命名为Exh A、Exh B、Exh C，还有一种在抗原性与上述蛋白有显著不同的蛋白Exh D。Sato H等[4]发现并纯化了猪葡萄球菌脱落毒素蛋白（Staphylococcus hyicus exfoliative toxin，Shet）Shetb。Peter A等对猪葡萄球菌编码的Exh A、Exh B、Exh C和Exh D基因分别进行了克隆和测序，结果显示，编码这4种脱落毒素的基因序列长度为816bp～834bp。4种脱落毒素的氨基酸序列也与先前报导的猪葡萄球菌的Shetb和金黄色葡萄球菌脱落毒素ETA、ETB和ETD具有同源性。Exh A、Exh B和Exh C在丝氨酸酶催化位点的保守性上具有相似性，但是在Exh D中，推定的催化位点上由Glu替代了原来的 Asp[5－6]。对致病性松鼠源葡萄球菌携带的Exh C基因进行了原核表达，利用纯化的Exh C重组蛋白处理体外培养的BHK和L－929细胞后，能使细胞的Annexin－V／PI双染细胞比例显著增加，随后使细胞崩解。这些结果说明，Exh C具有强烈的细胞杀伤作用[7]。2011年8月本实验室从广东省增城某猪场患有EE的病猪分离到1株细菌，经葡萄球菌gap基因鉴定为猪葡萄球菌，命名为GDZC株，并从该菌株中检测到Exh C基因。目前国内尚无猪葡萄球菌Exh C毒素基因的报道，基于此我们对分离到的猪葡萄球菌GDZC株Exh C毒素基因进行了克隆测序及原核表达载体的构建，并进行了SDS－PAGE鉴定和Western blot分析，为进一步研制高效的猪葡萄球菌亚单位疫苗及诊断试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及载体 GDZC株于2010年8月分离自广东省广州增城某猪场暴发渗出性皮炎的病猪，经分子生物学及生化鉴定为猪葡萄球菌；大肠埃希菌DH 5α、BL21（DE3）及表达载体pET－28a（＋）为本实验室保存；PCR 2.1－TA克隆载体，广州英韦创津有限责任公司产品。

1.1.2 试剂及仪器 普通营养琼脂、营养肉汤培养基，广东环凯微生物试剂有限公司产品；T4DNA连接酶、高保真DNA聚合酶、Marker DL 2000，宝生物工程（大连）有限公司产品；NcoⅠ、NotⅠ等限制性内切酶，Fermentas公司产品；小量细菌DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒，广州美津生物技术有限公司产品；异丙基－BD－硫代半乳糖苷（IPTG），广州英韦创津有限责任公司产品；预染蛋白质分子质量标准，天根生化科技有限公司产品；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 引物的设计与合成 根据GenBank登录号AF515455猪葡萄球菌Exh C毒素基因序列设计引物。上游引物P1：5′－CCGCCATGGCTATGCATTCAAAACTATTAAGT－3′，下游引物P2：5′－TTAGCGGCCGCTTTAATTAATTGTTTGAGA TCTCT－3′。在上游引物中引入NcoⅠ酶切位点，下游引物中引入NotⅠ酶切位点。引物由广州英韦创津有限责任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的抽提 将－80℃保存的菌种复苏纯培养后，挑取单菌落接种于5mL营养肉汤培养基中，37℃培养过夜，次日取1mL～4mL菌液，按细菌小量基因组DNA抽提试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 Exh C基因的PCR扩增 以上述提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为高保真 Taq DNA 聚合酶（5U／μL）10μL，ddH2O 12 μL，P1 （10pmol／μL）1 μL，P2（10pmol／μL）1μL，DNA模板1μL，共25μL体系；反应条件：94 ℃ 4min；94 ℃ 1min，56 ℃1min，72 ℃ 1min，共35个循环；72 ℃延伸10min。PCR产物用12g／L的琼脂糖凝胶进行电泳观察结果。

1.2.3 Exh C毒素基因原核表达载体的构建及鉴定 按小量DNA凝胶回收试剂盒的说明书将扩增目的片段回收。回收产物以及pET－28a（＋）载体用NcoⅠ和NotⅠ进行双酶切回收后，按常规方法16℃连接过夜，次日进行转化大肠埃希菌DH 5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素（终浓度为50 μg／mL）和X－gal的LB固体培养基上，37℃培养12 h～16h。经蓝白斑筛选、质粒PCR及酶切鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，以确定所构建的重组载体的正确性。

1.2.4 目的蛋白在大肠埃希菌中的诱导表达及SDS－PAGE分析 将鉴定为阳性的重组质粒pET－28a（＋）－Exh C转入BL21（DE3）感受态中。挑取单个菌落接种于5mL含卡那霉素（终浓度为50μg／mL）的LB培养液中，170r／min，37℃培养过夜。次日按10mL／L的比例将种子液接种于5 mL含卡那霉素（终浓度为50μg／mL）的LB培养液中，37℃振摇培养至OD 600为0.6～1.0时，加入IPTG（终浓度为1mmol／L），37℃诱导表达4h，收集1mL菌液以12000r／min离心2min，沉淀用40μL pH7.4的PBS悬浮，再如上离心，重复3次，加入一定比例的5×SDS上样buffer水浴煮沸10min，设未诱导的菌、上清、诱导的BL21（DE3）菌和纯化后的蛋白进行SDS－PAGE分析。电泳结束后取出凝胶后进行染色、脱色，观察结果。

1.2.5 重组蛋白的 Western blot分析 将诱导后重组菌所表达的蛋白进行纯化，经120g／L的SDSPAGE电泳分析后，通过电转印系统将凝胶中的蛋白转到硝酸纤维素膜（NC膜）上，经50g／L的脱脂奶粉封闭后，依次加入一抗猪葡萄球菌阳性血清，HRP标记的兔抗猪二抗，最后用DAB显色观察结果[8]。

2 结果

2.1 Exh C基因的PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板，利用设计的一对特异性引物，对GDZC株进行PCR扩增。扩增产物经12g／L的琼脂糖凝胶电泳分析，结果在837bp处可见一条明显的条带，与预期大小相符（图1）。

图1 GDZC株Exh C基因的PCR扩增结果Fig.1 The results of GDZC strain Exh C gene amplification

2.2 Exh C毒素基因的序列分析

将克隆的Exh C脱落毒素基因经酶切鉴定后阳性的重组质粒送上海博尚生物技术有限公司测序，其核苷酸序列与GenBank中的已发表的猪葡萄球菌Exh C基因核苷酸及编码的氨基酸序列进行Blast比对。结果显示，与GenBank上已发表的猪葡萄球菌登录号AF515455（丹麦）及松鼠源葡萄球菌登录号JF755400（中国）HBXX06株的Exh C基因核苷酸同源性均为100%（图2）。

2.3 重组表达载体pET－28a（＋）－Exh C质粒的鉴定

用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NcoⅠ和NotⅠ进行双酶切和质粒PCR鉴定，获得了约为837bp大小的条带，与预期结果相符（图3）。测序结果表明，目的基因与表达载体正确连接，说明该重组质粒构建成功。

图2 Exh C基因序列及编码的氨基酸序列分析Fig.2 Analysis of Exh C gene sequence and encoded amino acids sequence

2.4 重组目的蛋白的诱导表达及SDS－PAGE分析

Exh C毒素基因的全长为837bp，编码279个氨基酸。将筛选出的阳性重组菌用IPTG诱导表达，并与诱导前及菌液上清的阳性重组菌SDSPAGE分析比较发现，在32ku处出现一条明显的蛋白条带，与预期蛋白分子质量基本一致（图4）。

2.5 重组蛋白的Western blot分析

Western blot分析结果表明，诱导纯化的重组蛋白与制备的猪葡萄球菌多克隆阳性血清发生反应后，在约32ku处出现一条清晰的条带（图5）。表明表达的重组蛋白能被猪葡萄球菌阳性血清所识别，具有良好的反应原性。

图3 重组表达质粒的双酶切鉴定Fig.3 Enzyme digestion identification of the recombinant plasmid pET－28a（＋）－Exh C

图4 诱导表达产物及纯化产物SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of induced expression products and purified products

图5 表达产物Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of the expression products

3 讨论

近年来，随着养殖集约化程度的增强和早期断奶技术的采用，EE对我国养猪业所带来的负面影响日益明显。猪葡萄球菌是引起EE的主要病原之一，其菌株可以分为有毒力型和无毒力型，在发病和健康的仔猪皮肤上可以分离到这两种类型的菌株[9]。把有毒力的猪葡萄球菌的纯培养物接种于无免疫力猪的划痕皮肤上能够复制该病，通过皮下注射SPF小猪也能复制成功[10]。而用无毒力的菌株皮下注射和划痕均未出现任何临床症状和组织学病理变化。现已证实不同致病菌株产生的表皮脱落毒素是引起EE的主要致病因子，主要包括Exh A、Exh B、Exh C、Exh D、Shetb。目前控制猪葡萄球菌的感染尚未有商品化的疫苗，通常采用自制疫苗来预防和控制EE的发生。由于各菌株携带基因型的多样性影响了有效的交叉保护性疫苗的研制以及抗体诊断方法的研究。因此，研制高效的基因工程疫苗和抗体诊断方法迫在眉睫。

本研究分离的GDZC株猪葡萄球菌Exh C脱落毒素基因片段大小为837bp，Blast序列比对结果显示，与GenBank上已发表的猪葡萄球菌丹麦分离株（AF515455）和松鼠源葡萄球菌中国河北（JF755400）HBXX06株的核苷酸序列同源性为100%。脱落毒素Exh C基因编码279个氨基酸，同源性比较未发现碱基的缺失及突变，表明脱落毒素Exh C基因具有较高的保守性。说明本实验室分离的携带脱落毒素Exh C基因的菌株与国外带毒菌株不存在地域与时间上的差异。

2006年从河北省暴发EE的某猪场病猪分离到松鼠源葡萄球菌，结果发现该菌株携带有Exh C基因，并能在乳鼠和仔猪成功复制出EE的动物模型。Exh C是脱落毒素的一种，具有较强的细胞毒性，并且能明显抑制巨噬细胞的吞噬活性。先天性免疫是机体的第一道防线，而巨噬细胞是构成先天性免疫应答的主要吞噬细胞，因此推测葡萄球菌可能是通过Exh C抑制动物机体的先天性免疫从而进一步产生致病作用[11－14]。本研究将酶切的Exh C基因片段插入pET－28a（＋）载体，成功构建了pET－28a（＋）－Exh C原核表达载体。SDS－PAGE分析，从超声波裂解的菌体中获得了一条较浓的蛋白条带，其分子质量大小约为32ku，而菌液上清中含有少量的蛋白。因此，该蛋白主要以包涵体形式存在。在对诱导表达条件的摸索过程中发现，当IPTG终浓度为1 mmol／L时，诱导4h其蛋白的表达量最高。Western blot分析表明表达纯化的重组蛋白能被猪葡萄球菌阳性血清所识别，具有良好的免疫学活性。

本研究成功对GDZC株所携带的脱落毒素Exh C基因进行了基因克隆以及重组表达质粒的构建，获得了免疫原性较好的重组蛋白，为猪葡萄球菌抗体间接ELISA检测方法的建立、高效猪葡萄球菌亚单位疫苗及诊断试剂的研制奠定了基础。

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