荷斯坦奶牛干扰素tau 基因的克隆表达及生物活性分析

张 灿

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

Ⅰ型干扰素包括多个成员，具有抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节的功能，并具有种属特异性。干扰素tau（IFN－tau）作为Ⅰ型干扰素的一种，与其他Ⅰ型干扰素具有共同的特性，但与其他Ⅰ型干扰素不同的是，IFN－tau仅在反刍动物妊娠发育初期的胚胎滋养层细胞中表达，是反刍动物妊娠识别信号，有抗黄体溶解的作用。Ⅰ型干扰素其他成员如IFN－α、IFN－β和IFN－ω 均需要诱导产生，而IFN－tau的产生无需诱导，但是其抗病毒活性较弱[1]。IFN－α、IFN－β均具有抗病毒活性，可用于抗病毒药物的开发，但是存在细胞毒性，而IFN－tau虽然抗病毒活性较弱，但是不会产生细胞毒性[2]。在Ⅰ型干扰素中，IFN－tau与IFN－ω 同源性最高（70%～75%），与IFN－α、IFN－β也有一定的同源性[3]。

Ⅰ型干扰素的抗病毒作用主要是通过阻断病毒复制完成的。据报道，羊的IFN－tau能够诱导干扰素刺激因子（ISG）如 STAT－1、STAT－2、β－微球蛋白、IRF－1、UCRP、MX－1以及 OAS的表达，从而达到抗病毒的目的[4]。Kang D 等[5]检测了牛IFN－tau诱导MDBK细胞产生的ISG，发现 MX－1和OAS表达量增高，而IRF－1的表达量没有变化。

本研究克隆了BoIFN－tau基因，使用原核表达系统表达重组蛋白，并检测其抗病毒活性以及诱导ISG表达的情况，以期为IFN－tau抗病毒产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

荷斯坦奶牛外周血采自青岛奥特奶牛场。表达载体pET－30a（＋）、大肠埃希菌BL21、牛肾细胞／水疱性口炎病毒（MDBK／VSV）由青农大预防兽医学实验室保存；pGEM T－easy，Promega公司产品；RT－PCR提取试剂盒、DNA 限制性 内切酶、T4 DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶、IFN－α标准品，宝生物工程（大连）有限公司产品；ProBondTM Purification System试剂盒，Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 编码BoIFN－tau基因的克隆 从荷斯坦奶牛外周血提取总RNA，根据GenBank中牛IFN－tau序列（GI：AY996048）设计引物，RT－PCR 扩 增BoIFN－tau基因，引物序列为：上游5′－ATG GCC TTC GTG CTC TCT ACT－3′；下游5′－TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC－3′，反应体系 25μL，Tm为57℃，30个循环。参照Promega公司pGEM T－easy载体使用说明书将扩增产物连接到pGEM T－easy载体上，构建重组质粒BoIFN－tau／T。对重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。测序正确的BoIFN－tau序列用SignaI P3.0Server在线分析软件预测其信号肽序列长度。BoIFN－tau成熟肽序列与GenBank发表的序列进行同源性比对（大额牛：AY665674；亚洲水牛：AY535404；山羊：DQ154135；林麝：DQ139308；长颈鹿：U55050；牦牛：JH884172；绵羊：AY499657；美洲野牛：AY643747），DNASTAR软件进行进化分析。

1.2.2 BoIFN－tau基因原核表达载体的构建 以测序正确的BoIFN－tau／T质粒为模板，设计引物扩增BoIFN－tau成熟肽基因，引物序列如下：上游5′－CTA GAA TTC GGA CGA TCT CTG GGT TGT TAC－3′；下游5′－TTA CTC GAG AGT TAG CGA GAG TCA TCT CAA AG－3′，分别在5′和3′端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点（划横线部分）。将扩增得到的编码成熟肽的序列插入载体pET－30a（＋），构建重组质粒pET／BoIFN－tau，对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定。

将 pET／BoIFN－tau 质粒转化到 E.coli BL21（DE3）中，在含100g／mL Amp的LB培养基中于30℃条件下培养至A 600为0.6，1mmol／L的IPTG诱导表达5h，取样1mL，离心收集菌体，进行SDSPAGE和Western blot分析。表达菌所用一抗为鼠抗His单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的兔抗鼠IgG抗体。用ProBondTM Purification System试剂盒纯化诱导表达的重组蛋白BoIFN－tau。

1.2.3 重组蛋白BoIFN－tau抗病毒活性测定 采用细胞病变抑制法在牛肾细胞（MDBK）／VSV系统上测定重组蛋白BoIFN－tau的抗病毒活性，同时设立IFN－α标准品作为对照[6]。以能抑制50%细胞病变的BoIFN－tau最高稀释度为1单位。

1.2.4 BoIFN－tau刺激因子 Mx－1和 OAS表达量的检测 用6孔培养板培养MDBK细胞，在培养液中添加BoIFN－tau（250ng／mL），设置未诱导对照孔及IFN－α（5ng／mL）诱导对照孔。继续培养9h，离心收集细胞提取总RNA。RT－PCR扩增管家基因GAPDH（引物及反应参数见表1），根据电泳结果调整RNA模板量达到一致。参考Kang D等[5]发表的引物，扩增Mx－1和OAS基因（引物及反应参数见表1），分析比较Mx－1及OAS的表达量。

表1 BoIFN－tau刺激因子引物序列及PCR反应参数Table1 The BoIFN－tau stimulation factor primers and PCR reaction parameter

2 结果

2.1 BoIFN－tau基因的克隆及其同源性分析

重组质粒BoIFN－tau／T PCR鉴定和酶切鉴定结果显示获得了582bp的目的片段，测序结果表明获得了正确的基因序列。重组表达质粒pET／BoIFN－tau的PCR鉴定和双酶切鉴定显示目的片段大小为525bp，与预期结果相符（图1）。经SignaI P3.0Server在线分析软件预测，BoIFN－tau序列的1位～19位氨基酸组成信号肽，其余的174个氨基酸组成成熟肽。通过Blast分析不同反刍动物IFN－tau成熟肽序列同源性，用DNA Star进行系统演化分析，并绘制进化树（图2）。从图2可以看出，林麝的IFN－tau单独成一支，牦牛、荷斯坦奶牛、大额牛和亚洲水牛的组成一支，绵羊、山羊、美洲野牛和长颈鹿的组成一支。

图1 重组质粒BoIFN－tau／T及pET／BoIFN－tau鉴定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid BoIFN－tau／T and pET／BoIFN－tau

图2 BoIFN－tau成熟肽序列进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of BoIFN－tau mature peptide sequence in Holstein cow

2.2 重组蛋白BoIFN－tau的表达、鉴定和纯化

用IPTG诱导重组蛋白BoIFN－tau在大肠埃希菌BL21中表达，SDS－PAGE与 Western blot分析结果显示，获得的目的蛋白条带占菌体总蛋白的30%左右，大多以不溶性包涵体形式存在，大小约为23ku，与预期结果一致 （图3）。纯化的目的蛋白浓度达0.57mg／mL。

图3 重组BoIFN－tau蛋白的SDS－PAGE和Western blot检测Fig.3 SDS－PAGE and Western－blot of the recombinant BoIFN－tau protein

2.3 重组蛋白BoIFN－tau抗病毒活性测定

在MDBK／VSV细胞系上，采用细胞病变抑制法测定大肠埃希菌表达的BoIFN－tau蛋白抗病毒活性。BoIFN－tau活性为1.09×105IU／mL，IFN－α活性为6.49×105IU／mL。半定量PCR法检测IFN－tau诱导的Mx－1和OAS表达量（图4）。与未诱导对照比较，BoIFN－tau能够诱导 Mx－1和OAS的表达量显著升高；与IFN－α对照比较，Mx－1和OAS的表达量没有明显区别。

图4 半定量RT－PCR检测重组蛋白BoIFN－tau诱导的ISG表达量Fig.4 Analysis of ISG expression induced by BoIFN－tau by semiquantitative RT－PCR

3 讨论

本研究克隆了BoIFN－tau基因并在原核系统成功表达。测序结果显示，BoIFN－tau序列全长582bp，编码193个氨基酸组成的前体蛋白。起始的19个氨基酸为信号肽序列，成熟蛋白包含174个氨基酸。NCBI数据库Blast序列比对发现其与大多数奶牛编码IFN－tau的序列差异很小，与IFN－tau（HQ235019）序列的同源性为100%。与其他物种比较，与牦牛、大额牛和亚洲水牛的亲缘关系较近。

Ⅰ型干扰素具有抗病毒的作用。其作用机制为Ⅰ型干扰素与受体结合后，能够通过Jak－STAT信号通道激活干扰素刺激因子的合成，如 Mx－1、2′－5′寡聚腺苷酸合成酶（OAS）等[7]。Mx－1是Ⅰ型干扰素诱导产生的抗病毒产物，具有GTP酶活性，能直接发挥抗病毒作用[8]。动物模型试验表明，在没有IFN－α或IFN－β诱导产生其他蛋白的情况下，Mx－1能够有效阻断病毒的复制[9－10]。OAS通过介导细胞内信号转导，能够引起病毒RNA的降解，从而达到抗病毒的目的[11]。本研究检测了BoIFN－tau诱导下OAS和Mx－1的表达情况，结果表明与未诱导对照相比，BoIFN－tau能够使OAS和 Mx－1基因的表达量增加，说明BoIFN－tau的抗病毒活性机制与其他Ⅰ型干扰素抗病毒活性机制相似。与IFN－α对照比较，BoIFN－tau诱导的OAS和 Mx－1基因的表达量没有明显区别，表明BoIFN－tau在诱导抗病毒蛋白的表达量上与IFN－α没有区别，但是其最终抗病毒活性弱于IFN－α，这可能与IFN－α比IFN－tau在MDBK细胞中与受体的亲和力更高有关[12]，其原因需要进一步分析验证。

研究表明，IFN－α、IFN－β具有高效的抗病毒活性，能够有效的抑制多种病毒的复制和转录[13－14]，但是在作为药物治疗过程中有副作用，能够引起急性细胞因子中毒的症状[15]。IFN－tau作为Ⅰ型干扰素同样具有抗病毒活性，且IFN－tau副作用比IFN－β的小[15]。因此，在反刍动物抗病毒治疗中，IFN－tau与IFN－α、IFN－β相比，具有更高的安全性和更广泛的临床应用价值。本研究为Bo IFN－tau抗病毒产品的开发奠定了基础。

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