维生素E 对炔雌醚致雄性小鼠生殖毒性的保护作用

李 健，陈耀星，王子旭，曹 静，董玉兰，陈树林

（1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100）

各种促凋亡信号（如环境不利因素、损伤、辐射、化疗药物、兴奋性氨基酸、死亡配体等）都引起细胞内源性或外源性活性氧（ROS）升高或氧化还原平衡改变，这可能作为信号触发凋亡信号转导途径。当凋亡启动后，ROS进一步升高可能加速凋亡过程。目前发现细胞凋亡存在3条途径，即线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路均与ROS密切相关。研究证实，一些植物提取物和环境激素引发的生殖损害多与氧化应激有关[1－2]。精液中脂质过氧化物含量与精子运动力成反比，同时精子顶体对活性氧（ROS）非常敏感，因此机体过氧化水平与雄性生殖密切相关[3]。前期研究发现，炔雌醚显著下降，小鼠抗氧化酶活性、活性氧显著增加，机体抗氧化能力下降，因此，提高机体抗氧化能力是保护雄性生殖的有效途径。维生素E与其他抗氧化剂如维生素C、谷胱甘肽及微量元素硒（Se）等协同作用，可使其清除和防御ROS的过氧化损伤更加有效；以及抗衰老、增强机体免疫力等作用[4－5]。本试验通过炔雌醚诱导小鼠生殖损伤，研究维生素E对雄性生殖损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 15只成年雄性昆明小鼠，购自河南省实验动物中心，平均体重30g±2g，自由采食、饮水，于每天14h光照，10h黑暗的条件下进行饲喂。

1.1.2 试剂 姬姆萨染液、橄榄油、血球计数器、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、总抗氧化能力（T－AOC）、丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）试剂盒，安迪生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 经7d适应后，随机分为3组（每组5只）。A组为对照组，灌胃50μL橄榄油，B组灌胃50μL橄榄油含1mg／kg炔雌醚，C组灌胃50μL橄榄油含1mg／kg炔雌醚和100mg／kg维生素E，每天1次，连续3周。处理结束后，将小鼠麻醉处死，取双侧睾丸、双侧附睾、精囊腺称重，计算器官相对重量：相对重量＝器官重量（g）／体重（kg）。

1.2.2 睾丸抗氧化能力检测 一侧睾丸匀浆处理后用ELISA试剂盒检测抗氧化能力。

1.2.3 精子数量、活率、顶体完整及畸形率检测

将一侧附睾尾剪开，使精液在37.5℃生理盐水中自由散开。根据精子密度的高低稀释精液，准确记录精液稀释倍数。然后吸取少量精液，用血球计数器进行精子密度检测。取少许精液制作抹片，进行Giemsa染色，观察顶体反应和精子畸形情况。精子数量以×106／mL表示（n＝5），精子活率、畸形率、顶体完整率分别以百分数（%）表示。

1.2.4 数据统计 以上数据用SPSS12软件包进行单因素方差分析（One Way ANOVA），以平均值±标准差表示，P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 维生素E对炔雌醚处理小鼠睾丸抗氧化能力的影响

与对照组相比，炔雌醚组 SOD、GSH－Px、TAOC的活性分别为 105.41U／mL、17.82U／L、4.62U／mL，显著下降；MDA、NO含量分别为5.62nmol／mL、14.58μmol／L，显著升高。100mg／kg维生素E显著抑制了炔雌醚引起的MDA、NO含量升高，并改善了炔雌醚引起的SOD、GSH－Px、TAOC活性下降，恢复抗氧化能力（P＜0.01）（表1）。

2.2 维生素E对炔雌醚处理小鼠睾丸、附睾、精囊腺及前列腺的保护作用

与对照组相比，炔雌醚组睾丸、附睾、精囊腺、前列腺的重量分别下降34.24%、48.02%、46.15%和43.48%（P＜0.01）；维生素E显著增加炔雌醚处理后小鼠睾丸、附睾、精囊腺、前列腺的重量（P＜0.01）（表2）。

2.3 维生素E对炔雌醚处理小鼠精子数量、活率、畸形率的恢复

由表3可见，炔雌醚引起小鼠精子品质显著下降。精子数量、精子活率及顶体完整率分别下降到13.24×106、48.21%和60.51%；精子畸形率升高到27.31%。100mg／kg维生素E对1mg／kg炔雌醚处理后小鼠精子数量具有一定的恢复作用，显著升高精子数量、精子活率及顶体完整率，并降低精子畸形率，使各项精子指标接近于对照组水平。

表1 维生素E恢复炔雌醚处理小鼠睾丸抗氧化能力的比较Table1 Comparison of antioxidant capacity with quinestrol treatment before and after recovery of vitamin E

表2 维生素恢复炔雌醚处理小鼠生殖器官重量的比较Table2 Comparison of organ weight with quinestrol treatment before and after recovery of vitamin

表3 维生素恢复炔雌醚处理小鼠精液品质的比较Table3 Comparison of the semen quality with quinestrol treatment before and after recovery of vitamin

3 讨论

大量研究证实，环境雌激素可造成很多雄性生殖系统疾病，胚胎期、出生前后或成年动物接触己烯雌酚（DES）均可导致雄性生殖损害[6]。炔雌醚也能够破坏雄性动物生殖器官的发育和功能[7－8]。维生素E是外源抗氧化剂，能够提高3β－羟脱氢酶、17β－羟脱氢酶活性，并提高机体抗氧化水平，增强对ROS的清除作用，缓解氧化损伤，同时升高血浆睾酮含量[9]。Li XM 等[10]研究证实，维生素E可升高SOD、CAT、GSH－Px及 T－AOC的活性、增强老龄小鼠的抗氧化能力。马爱团[11]证实维生素E能够有效对抗DES诱导的氧化应激，提高机体抗氧化能力，降低脂质过氧化物的含量，增加生殖器官的重量并恢复器官形态和组织结构，从而缓解生殖损伤。高春燕等[12]发现维生素E对多种自由基均有不同程度的清除作用，清除能力相当。本试验结果显示，应用炔雌醚连续3周处理雄性小鼠导致睾丸、附睾、精囊腺和前列腺萎缩，重量均显著降低，而采用维生素E处理后，明显改善了炔雌醚引起的生殖损伤。维生素E对精子指标也有很大改善，100mg／kg维生素E显著提高精子数目，降低精子畸形，但补充维生素E组与对照组仍有一定差距。Luo Q等[13]研究发现，维生素E对半侧睾丸摘除后大鼠生精的恢复作用，结果连续14d应用10mg／kg显著增加大鼠精子数量及精子活力，两项指标均恢复至对照组水平，推测维生素E的应用时间对精子恢复有一定影响。本试验结果表明，维生素E显著提高体内SOD、GSH－Px及 T－AOC活性，降低 MDA 与 NO含量，增强抗氧化能力。因此，维生素E对雄性生殖具有保护作用，抗氧化是生殖保护的有效途径之一。

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