PLCε1基因多态性与食管癌遗传易感性的关联研究

周荣秒 王 娜 牛朝旭 黄 茜 霍向然 李 琰

PLCε1基因多态性与食管癌遗传易感性的关联研究

周荣秒①王 娜①牛朝旭②黄 茜①霍向然①李 琰①

目的：探讨PLCε1基因rs2274223 A/G单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和rs11599672 T/G SNP与河北省磁县高发区人群食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）遗传易感性之间的关系。方法：采用聚合酶链反应-连接酶检测反应（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR）方法对527例ESCC患者和527例健康对照PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP进行基因分型。结果：ESCC患者组上消化道肿瘤（upper gastrointestinal cancer，UGIC）家族史阳性个体比例为48.6%，显著高于健康对照组（39.3%，χ2=9.25，P=0.002）。ESCC患者组及健康对照组PLCε1基因rs2274223 A/G SNP AA、AG、GG基因型频率分别为48.0%、43.9%、8.1%和57.1%、37.5%、5.4%。与AA基因型相比，携带AG、GG、AG/GG基因型可能增加ESCC的发病风险，经年龄、性别、吸烟状况、UGIC家族史校正后的OR值分别为1.41（95%CI=1.09～1.83）、1.71（95%CI=1.03～2.86）、1.45（95%CI=1.13～1.85）。PLCε1基因rs11599672 T/G SNP等位基因频率和基因型频率总体分布在ESCC患者组及健康对照组之间无显著性差异（P＞0.05）。应用2LD软件对PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP进行联合分析显示，两个多态性位点间不存在连锁不平衡现象（D'=0.11）。与最常见的AT单体型相比，GT单体型增加了ESCC的发病风险（OR=1.36，95%CI=1.08～1.71）。结论：PLCε1基因rs2274223 A/G SNP可以作为高发区人群ESCC遗传易感性的标志物。UGIC家族史阳性个体、携带PLCε1基因rs2274223 A/G SNP AG、GG基因型的个体罹患ESCC的风险较高，应定期接受食管内镜检查，以便真正实现ESCC的早期诊断、早期治疗。

PLCε1基因 单核苷酸多态性 食管鳞状细胞癌 遗传易感性

河北省磁县是食管癌的高发区，食管癌的发生存在家族聚集现象提示遗传背景在食管癌的发生中起着重要作用。本文前期对候选基因的研究已经识别了一些与磁县人群食管癌遗传易感性相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点。但是迄今为止，食管癌易感性的遗传基础仍不太明确。最近三个全基因组关联研究先后报道PLCε1基因rs2274223 A/G SNP与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的发病风险相关［1-3］。全基因组关联研究的结果需要在另外的具有合适样本量的研究中进行验证。另外，生物信息学分析表明rs11599672 T/G SNP位于PLCε1基因转录因子的结合位点，碱基T→G的颠换可能导致PLCε1基因转录活性和表达水平的改变。

PLCε1是磷脂酶C家族成员，作为Ras原癌基因的效应子，在多种肿瘤的发生进展过程中发挥重要作用。本研究将探讨PLCε1基因rs2274223 A/G SNP、rs11599672 T/G SNP与磁县食管癌高发区人群ESCC遗传易感性的关系，寻找能够预测ESCC高风险个体的标志物，为食管癌遗传易感性的研究提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究包括527例ESCC患者和527例健康对照者。527例ESCC患者是2006年1月至2011年7月在河北省磁县经内镜普查并在当地医院经组织学检查确诊的门诊或住院患者。食管癌均为鳞状细胞癌。健康对照为在相同时间同一地区体检正常且内镜检查无上消化道肿瘤（upper gastrointestinal cancer，UGIC）的个体。肿瘤患者及健康对照者的年龄、性别、吸烟习惯及家族史的情况均由专人询问获得。最终选取年龄、性别与病例相匹配的527例健康者作为对照。现在吸烟或者曾经吸烟每天5支以上，并且持续两年或者两年以上者定义为吸烟个体。家族中有1名以上一级亲属和/或2名以上二级亲属患有食管癌/贲门癌/胃癌者定义为上消化道肿瘤家族史阳性。所有研究个体签署了书面知情同意书。研究由河北医科大学第四医院医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集及外周血白细胞DNA的提取

所有研究个体均采集静脉血5 mL，经枸橼酸钠抗凝，4℃冰箱保存。采血后1周内，以蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA。

1.3 PLCε1基因SNPs分型

采用聚合酶链反应-连接酶检测反应（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR）方法对PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP进行基因分型。实验由上海捷瑞生物工程有限公司完成。针对每一个SNP位点的各基因型均随机选择10% PCR产物进行测序，以验证分型结果的准确性。

1.4 统计学分析

数据统计分析采用SPSS 11.5版软件包进行。对照组基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组与对照组的基因型频率分布比较均采用行×列表卡方检验。单体型频率及连锁不平衡分析采用EH软件和2LD软件，以非条件Logistic回归法计算经年龄、性别、吸烟状况和UGIC家族史校正的相对风险度的比值比及其95%可信区间。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般特征

ESCC患者及健康对照的人口分布特征见表1。ESCC患者组及健康对照组男性347例、女性180例。ESCC患者组平均年龄为（60.3±8.73）岁，年龄分布为32～85岁；健康对照组平均年龄为（60.1±8.50）岁，年龄分布为34～82岁。ESCC患者组与健康对照组间的性别、年龄构成比均无显著性差异（P＞0.05）。

ESCC患者组吸烟个体比例为42.3%，与健康对照组（40.8%）相比无显著性差异（χ2=0.25，P=0.62）。因此，吸烟并未影响高发区人群ESCC的发病风险。

ESCC患者组UGIC家族史阳性个体比例为48.6%，显著高于健康对照组（39.3%）（χ2=9.25，P= 0.002），UGIC家族史可显著增加ESCC的发病风险，经年龄、性别、吸烟状况校正后的OR值为1.47（95% CI=1.15～1.87）。

2.2 PLCε1基因rs2274223 A/G SNP与ESCC发病风险的关联分析

517例ESCC患者和510例健康对照者的DNA标本经PCR-LDR方法成功检测了rs2274223 A/G SNP基因型，且测序结果与原始分型结果相符。

PLCε1基因rs2274223 A/G SNP基因型分布在健康对照组中符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.21，P= 0.65）。PLCε1基因rs2274223 A/G SNP的A和G等位基因在ESCC患者组及健康对照组的频率分别为69.9%、30.1%和75.8%、24.2%（表2）。ESCC患者组的G等位基因频率显著高于健康对照组的G等位基因频率（χ2=8.92，P=0.003），携带G等位基因可能增加ESCC的发病风险（OR=1.35，95%CI=1.11～1.64）。ESCC患者组及健康对照组的AA、AG、GG基因型频率分别为48.0%、43.9%、8.1%和57.1%、37.5%、5.4%。与AA基因型相比，携带AG、GG、AG/GG基因型可能增加ESCC的发病风险，经年龄、性别、吸烟状况、UGIC家族史校正后的OR值分别为1.41（95%CI= 1.09～1.83）、1.71（95%CI=1.03～2.86）和1.45（95% CI=1.13～1.85）。根据年龄、性别、吸烟状况和UGIC家族史进行分层分析发现，rs2274223 A/G SNP与ESCC遗传易感性的关联在各层之间无显著性差异（表3）。

2.3 PLCε1基因rs11599672 T/G SNP与ESCC发病风险的关联分析

517例ESCC患者和509例健康对照者的DNA标本经PCR-LDR方法成功检测了rs11599672 T/G SNP基因型，且测序结果与原始分型结果相符。

PLCε1基因rs11599672 T/G SNP基因型分布在健康对照组中符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.46，P= 0.50）。PLCε1基因rs11599672 T/G SNP的T和G等位基因在ESCC患者组及健康对照组的频率分别为73.0%、27.0%和72.7%、27.3%（表2）。ESCC患者组及健康对照组的TT、TG、GG基因型频率分别为52.6%、40.8%、6.6%和53.4%、38.5%、8.1%。PLCε1基因rs11599672 T/G SNP等位基因和基因型频率总体分布在ESCC患者组及健康对照组之间无显著性差异（P＞0.05）。与TT基因型相比，携带TG、GG、TG/GG基因型未改变ESCC的发病风险。根据年龄、性别、吸烟状况和UGIC家族史进行分层分析发现，与TT基因型相比，携带TG/GG基因型亦未改变ESCC的发病风险（表4）。

2.4 PLCε1基因SNPs连锁不平衡分析及单体型分布与ESCC发病风险的关联分析

应用2LD软件对PLCε1基因的rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP进行联合分析显示，两个多态性位点间不存在连锁不平衡现象（D'=0.11）。

人群中最常见的单体型为AT，其在健康对照组中的分布频率为55.2%，其他单体型频率分别为AG（20.7%）、GT（17.5%）和GG（6.6%）。GT单体型增加了ESCC的发病风险（OR=1.36，95%CI=1.08～1.71）（表5）。

表1 ESCC患者与健康对照者特征分布 n（%）Table 1 Distribution of selected characteristics of ESCC patients and healthy controls

表2 PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP与ESCC易感性的关系 n（%）Table 2 Correlation of PLCε1 gene rs2274223 A/G SNP and rs11599672 T/G SNP to susceptibility of ESCC

表3 PLCε1基因rs2274223 A/G SNP与ESCC发病风险关系的分层分析Table 3 Stratification analysis for the association between PLCε1 gene rs2274223 A/G SNP and ESCC risk

表4 PLCε1基因rs11599672 T/G SNP与ESCC发病风险关系的分层分析Table 4 Stratification analysis for the associations between PLCε1gene rs11599672 T/G SNP and ESCC risk

表5 PLCε1基因单体型与ESCC发病风险 n（%）Table 5 PLCε1 gene haplotype and ESCC risk

3 讨论

食管癌的发生是环境因素和遗传因素长期相互作用的结果，与其发生相关的环境因素包括吸烟、饮酒、进食腌制蔬菜、富含亚硝胺的食物、黄曲霉菌污染的食物、HPV感染等［4］。本研究表明吸烟并未增加磁县高发区人群ESCC的发病风险。与Tran等［4］的研究结果一致，吸烟是影响中国高发区人群食管癌发生的较小的危险因素。UGIC家族史增加了ESCC的发病风险，提示遗传背景在ESCC发生中起着重要作用。

PLCε1是磷脂酶C家族成员，在炎性过程中起着重要的作用。用凝血酶或鞘氨醇-1磷酸处理来自野生型鼠和PLCε1敲除鼠的原代培养的星形细胞，野生型鼠星形细胞的炎性因子COX-2、IL-6、IL-1 β mRNA水平明显增加［5］。培养的表皮角化细胞和真皮成纤维细胞在紫外线B照射后以PLCε1依赖的方式产生CXCL1/KC，PLCε1通过调节CXCL1/KC的表达在嗜中性粒细胞相关的皮肤炎症中发挥关键作用［6］。

炎症是维持肿瘤发展局部环境的重要因素之一，在肿瘤的启动、促进、恶性转化、浸润以及转移过程中的作用均很重要。Bai等［7］发现PLCε1在佛波酯的下游发挥促进肿瘤发生的作用。随后的研究表明，PLCε1的作用可能归因于其扩大了炎症反应［8］。PLCε1通过增加炎症反应和血管形成促进鼠肠道肿瘤的发生［9］。

以往的研究表明，炎性食管疾病增加了ESCC的发病风险。Wang等［10］报道，内镜及病理学检查证实58个ESCC患者中89.7%的个体表现不同程度的食管炎，而10 614例非ESCC对照中仅仅14.3%的个体患有食管炎，再次证明炎性食管疾病与ESCC之间的关联。

PLCε1基因rs2274223 A/G SNP位于C2结构域，碱基A→G的转换引起所编码的氨基酸改变，可能影响蛋白之间的相互作用和/或与脂类的结合，最终引起功能改变。本研究结果提示与AA基因型相比，携带AG、GG、AG/GG基因型均增加了ESCC的发病风险。Wang等［10］的研究认为，G等位基因通过上调PLCε1 mRNA、蛋白的表达水平，增加PLCε1的酶活性，增加食管黏膜上皮的炎性反应，而长期慢性炎性刺激促进ESCC的发生。这一理论支持本研究结果。

PLCε1基因rs2274223 A/G SNP G等位基因增加了中国东部汉族人群、中部汉族人群、西部哈萨克族人群、韩国人群ESCC的发病风险［1-14］。Palmer等［15］发现G等位基因降低了高加索人ESCC的发病风险，有研究则提示rs2274223 A/G SNP与ESCC的易感性无关［16-17］。研究人群遗传背景和样本量的差异可能是结果不一致的原因，设计合理、大样本的研究得出的结果应该更可靠、更有代表性。按照年龄、性别、吸烟状况、UGIC家族史进行分层分析发现，在不同的亚组rs2274223 A/G SNP与ESCC发病风险之间的关系无显著性差异，与报道的研究结果一致［1-3］。

以往的研究表明PLCε1基因rs11599672 T/G SNP可能与非西班牙白人吸烟、饮酒相关的非口咽部头颈鳞状细胞癌遗传易感性相关［18］。但是本研究结果显示，无论是总体还是分层分析，rs11599672 T/G SNP均与ESCC的发病风险无关，其原因ESCC与头颈鳞状细胞癌的病因和发病机制不同；另外可能与研究对象遗传背景的差异有关；或者本研究的样本量较小，不足以探测到rs11599672 T/G SNP与ESCC之间微弱的关联。

单体型分析发现，与最常见的AT单体型比较，GT单体型增加ESCC的遗传易感性，这一结果反映了rs2274223 A/G SNP G等位基因主要的风险效果。

综上所述，PLCε1基因rs2274223 A/G SNP可以作为预测河北省磁县食管癌高发区人群ESCC发病风险的标志物。UGIC家族史阳性的人群和携带风险等位基因的人群应定期接受食管内镜检查，便于早期发现、早期诊断、早期治疗食管癌患者，最终才能提高食管癌患者的生存率。

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（2014-06-10收稿）

（2014-08-20修回）

（本文编辑：周晓颖）

Association between PLCε1 gene polymorphisms and susceptibility to esophageal carcinoma

Rongmiao ZHOU1,Na WANG1,Chaoxu NIU2,Xi HUANG1,Xiangran HUO1,Yan LI1

Yan LI;E-mail:lykx1962@163.com
1Hebei Provincial Cancer Institute,The Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2Department of Surgery,Shijiazhuang Pingan Hospital,Shijiazhuang 050021,China

Objective:To explore the association of PLCε1 gene rs2274223 A/G single nucleotide polymorphism(SNP)and rs11599672 T/G SNP with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)in a population of Ci County high-incidence region in Hebei Province.Methods:The genotypes of PLCε1 gene rs2274223 A/G SNP and rs11599672 T/G SNP were determined by polymerase chain reaction-ligase detection reaction method in 527 ESCC patients and 527 healthy controls.Results:The frequency of positive family history of upper gastrointestinal cancer UGIC in ESCC patients was 48.6%,which is significantly higher than that in the healthy controls(39.3%)(χ2=9.25,P=0.002).The AA,AG,and GG genotype frequencies of PLCε1 gene rs2274223 A/G SNP were 48.0%,43.9%,8.1%in the ESCC patients and 57.1%,37.5%,5.4%in the healthy controls,respectively.Compared with AA genotype, AG,GG,and AG/GG genotypes enhanced the risk of ESCC.The age,sex,smoking status,and UGIC family history-adjusted OR were 1.41(95%CI=1.09-1.83),1.71(95%CI=1.03-2.86),and 1.45(95%CI=1.13-1.85),respectively.No significant difference was observed in the frequency of the genotype and allele of PLCε1 gene rs11599672 T/G SNP between the ESCC cases and the controls(P＞0.05). PLCε1 gene rs2274223 A/G SNP and rs11599672 T/G SNP were combined for analysis using a 2LD software.Results showed that no linkage disequilibrium exists between these two SNPs(D'=0.11).Compared with the most frequent AT haplotype,the GT haplotype significantly increased the risk of ESCC(OR=1.36,95%CI=1.08-1.71).Conclusion:PLCε1 gene rs2274223 A/G SNP might serve as a marker predicting genetic susceptibility to ESCC of the population from Ci County.The subjects with UGIC family history and the AG-or GG-genotype carriers had higher risk of ESCC and should receive periodic upper gastrointestinal fiber tests for early detection and treatment of ESCC.

PLCε1 gene,single nucleotide polymorphism,esophageal squamous cell carcinoma,genetic susceptibility

10.3969/j.issn.1000-8179.20140993

①河北医科大学第四医院，河北省肿瘤研究所分子生物学研究室（石家庄市050011）；②石家庄平安医院外科

李琰 Lykx1962@163.com

周荣秒 专业方向为肿瘤遗传学。

E-mail：rongmiaozhou@sina.com