肿瘤微环境对乳腺癌干细胞样微球体培养鉴定的影响*

朱玉芬 任美敬 谷 峰 付 丽

·基础研究·

肿瘤微环境对乳腺癌干细胞样微球体培养鉴定的影响*

朱玉芬 任美敬 谷 峰 付 丽

目的：探讨肿瘤微环境在乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSCs）培养鉴定及分化过程中的影响及意义。方法：采用无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液对乳腺癌细胞及MCF-7细胞进行原代培养。观察乳腺癌细胞微球体形成状况，MTT比色法检测乳腺癌细胞的增殖能力，免疫细胞化学方法检测乳腺癌干细胞标记物及上皮间质标记物的表达，并通过RT-PCR进行验证。结果：无血清培养液PCM-2培养的原代细胞微球体的直径大于成纤维细胞上清液的培养（t=4.996，P= 0.002），且原代细胞中ALDH1（aldehyde dehydrogenase 1）的表达率高于后者。成纤维细胞上清液培养的细胞生长速度较无血清培养液PCM-2快，差异具有统计学意义（P=0.004）。RT-PCR检测发现无血清培养液PCM-2培养的原代细胞中ALDH1表达上调，E-cadherin、Vimentin表达下调。结论：在乳腺癌原代细胞和MCF-7细胞中可以采用无血清悬浮培养方法富集BCSCs样微球体，成纤维细胞上清液能够促进BCSCs样微球体的增殖与分化。提示乳腺肿瘤微环境在乳腺癌细胞的生长增殖过程中发挥了至关重要的作用。

乳腺癌 乳腺癌干细胞 肿瘤微环境 无血清培养 微球体

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，具有高度的异质性和独特的组织学形态及高度转移的恶性生物学行为与对治疗的耐受性和抵抗性［1］。乳腺癌发生、发展及转移的根本原因可能是乳腺癌内存在着极少数具有自我更新和多向分化潜能的乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSCs）。随着越来越多研究者对BCSCs的深入探究，CD44+CD24-/low、ALDH1（aldehyde dehydrogenase 1）已经被公认为BCSCs可靠的标志物［2-3］。肿瘤的转移除了依赖于原发肿瘤细胞自身的增殖外，在很大程度上也依赖于肿瘤细胞及间质细胞相互作用形成的局部微环境。目前肿瘤的研究重点是破译肿瘤的转移过程。肿瘤微环境、细胞因子与趋化因子的相互作用、肿瘤的血管生成、免疫逃逸机制及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等会影响肿瘤的转移［4-6］。本研究旨在利用能够模拟体内微环境的成纤维细胞上清液及无血清培养液PCM-2培养的乳腺癌细胞，初步探究乳腺肿瘤微环境如何影响BCSCs的增殖与分化。

1 材料与方法

1.1 材料

1例天津医科大学肿瘤医院乳腺外科收治的原发性女性乳腺癌患者，经病理确诊为乳腺浸润性导管癌，未经化疗和放疗，在无菌条件下获取组织进行原代培养（经患者及其家属知情同意）。人乳腺癌细胞系MCF-7细胞购于中科院上海细胞生物研究所细胞库。细胞培养及研究所用的DMEM/F12购自上海立菲生物技术有限公司，无血清培养液PCM-2（primary culture medium-2）购自日本新田明胶公司，HBSS（Hank's balanced salt solution）液购自天津百若克医药生物技术有限公司，二甲基亚砜（DMSO）、MTT试剂购自美国Sigma公司，TECAN酶联免疫检测仪购自美国Quant公司，ALDH1（ab23375）购自英国Abcam公司，E-cadherin鼠抗人单克隆抗体（ZM-0092）、Vimentin鼠抗人单克隆抗体（ZM-0260）均购自北京中杉金桥生物公司，Trizol试剂与miRNA反转录引物均购自美国Invitrogen公司，Bio-Rad 2000 RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司，QuantiTect SYBR Green PCR Kit购自德国QLAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌细胞培养 在清洁条件下获取标本3～5 g，使用含抗生素的生理盐水冲洗3遍，剪去脂肪组织。剪碎后，使用少量HBSS液涮洗培养皿，移入50 mL离心管，加HBSS液至40 mL，3 000 r/min，离心3 min。弃上清，加HBSS液18 mL、消化酶2 mL，37℃震荡消化1～3 h。加DMEM/F12终止消化，追加HBSS液至30 mL，吹打，使用308 μm滤网过滤，3 000 r/ min，离心3 min。弃上清，加含有10%血清的培养液，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养。2～3 d换液1次，当细胞密度近90%时进行传代培养。将第3～5代内细胞给以无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液进行悬浮培养。

1.2.2 MTT比色法 将对数生长期细胞消化、离心，制备单细胞悬液，调整细胞浓度，接种于96孔培养板，每孔加入1×105/mL细胞，另设空白对照孔，培养12 h，细胞贴壁。分别于培养24、48、72、96、120 h后，加入20 μL/孔MTT（5 mg/mL），设置3个复孔，继续培养4 h，小心吸去培养液，再加入200 μL DMSO，振荡10 min。TECAN酶联检测仪以570 nm为检测波长，630 nm为参比波长，测定各孔光吸收值。

1.2.3 免疫细胞化学 将无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液培养的原代细胞进行细胞爬片，在4孔板的盖玻片上接种对数生长期细胞，待细胞均匀覆盖后弃培养液。PBS冲洗，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS冲洗，自然晾干。0.3%过氧化酶阻断溶液封闭30 min，正常血清封闭30 min，吸弃。滴加一抗，4℃过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照，采用三步免疫组织化学方法分别在细胞贴壁第1、3及5天时检测ALDH1、E-cadherin、Vimentin染色情况。DAB显色，苏木素复染，显微镜观察。

1.2.4 RT-PCR 利用Trizol法提取RNA并进行反转录，反应体系为20 μL。RT-PCR扩增miRNA，测定ALDH1、E-cadherin、Oct-4、Vimentin等基因表达，以GAPDH基因为内参。反应条件：95℃预变性15 min；95℃变性15 s、56℃退火30 s、68℃延伸30 s，共40个循环；每个反应设置2个复孔。miRNA表达水平的计算公式：ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。引物序列见表1。

表1 RT-PCR相关引物序列表Table 1 The sequence of relative primers in real-time reverse transcription polymerase chain reaction

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 微球体形成状况

在倒置相差显微镜下观察2种培养液培养的细胞生长状况：无血清培养液PCM-2培养的原代细胞3～5 d出现微球体形成，且随着天数的增加，微球体的直径越来越大，数目逐渐减少；而成纤维细胞上清液培养者，细胞逐渐伸展为长梭形，胞质丰富。无血清培养液PCM-2培养的原代细胞微球体直径大于成纤维细胞上清液的培养，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。2种培养液培养的MCF-7细胞的生长状况同原代细胞具有相似的结果。

2.2 MTT比色法检测细胞生长曲线

MTT比色法测定无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液培养的原代细胞及MCF-7细胞的生长，发现两者均处于持续生长的状态，但成纤维细胞上清液培养的细胞生长速度快于无血清培养液PCM-2培养的细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 免疫细胞化学检测结果

免疫细胞化学检测发现无血清培养液PCM-2培养的原代细胞中ALDH1表达率第1天较高于第3天及第5天，且第3天原代细胞中ALDH1表达率于无血清培养液PCM-2培养（46.40%±5.580%）高于成纤维细胞上清液的培养（19.03%±1.363%）。推测成纤维细胞上清液中成纤维细胞分泌的一些生长因子或趋化因子促进了BCSCs样微球体的增殖与分化（图2、3）。

2.4 RT-PCR检测

与无血清培养液PCM-2培养相比，成纤维细胞上清液培养的原代细胞中ALDH1表达下调，上皮间质标记物E-cadherin、Vimentin表达上调；同样成纤维细胞上清液培养的MCF-7细胞中，乳腺癌干细胞标记物ALDH1、Oct-4表达下调，E-cadherin、Vimentin表达上调（图4）。

图1 无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液培养的原代细胞微球体的形成状况（倒置相差显微镜×200）Figure 1 Status of microspheres formed in two different culture mediums（IPCM×200）

图2 无血清培养液PCM-2培养的原代细胞中ALDH1表达（SP×200）Figure 2 Expression of ALDH1 in primary breast cancer cells（SP×200）

图3 无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液培养的原代细胞中ALDH1表达（SP×200）Figure 3 Expression of ALDH1 in primary breast cancer cells in PCM-2 and the supernatant of cultured fibroblasts（SP×200）

图4 无血清培养液PCM-2及成纤维细胞上清液培养的乳腺癌细胞第3天时干细胞及上皮间质标记物表达Figure 4 Expression of stem cells and epithelial-mesenchymal markers in MCF-7 and primary breast cancer cells cultured in PCM-2 and in the supernatant of cultured fibroblasts for 3 d

3 讨论

乳腺癌是一种具有高度异质性的恶性肿瘤，临床治疗一定程度上能够抑制癌细胞的生长，但仍发生侵袭及转移，这可能与乳腺癌内存在着极少数具有干细胞特性的BCSCs有关。Al-Hajj等［2］首先发现具有干细胞特性的CD44+CD24-/low细胞，证实了BCSCs的存在。Ginestier等［3］提出相对于CD44+CD24-/low，较少量ALDH1阳性细胞即可在免疫缺陷小鼠体内成瘤。Sox-2、Oct-4是维持胚胎干细胞多能性和自我更新能力的关键转录因子，这些表面标记物的表达同实体瘤的不良预后呈正相关［7-8］。Ricardo等［9］研究表明，标记物ALDH1在HER-2过表达型及Basal-like型乳腺癌细胞中的表达率明显高于Luminal型。该研究中无血清培养液PCM-2培养的原代HER-2过表达型乳腺癌细胞中ALDH1表达率在第1天较高，第3天后ALDH1阳性细胞占46.4%±5.580%，明显高于对照组的19.03%±1.363%。推测原代培养的乳腺癌细胞中可能存在着少量的干细胞，且成纤维细胞上清液可能在BCSCs的增殖分化中发挥了关键的作用。

悬浮培养的一些乳腺癌细胞形成漂浮的克隆小球，即乳腺微球体（mammospheres）。这些微球体在三维立体培养时表现出自我更新和多向分化的能力，推测乳腺微球体中可能含有干细胞成分。本研究采用2种不同的培养液进行培养，其中成纤维细胞上清液中的成纤维细胞可以通过分泌一些胶原蛋白、纤连蛋白和多种细胞因子促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）生成，通过产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）调节ECM更新，进而通过各种信号通路影响肿瘤细胞的生长［10］。本研究发现，利用无血清培养液PCM-2培养的原代细胞微球体的直径大于成纤维细胞上清液的培养（P＜0.05）；RT-PCR检测成纤维细胞上清液培养的MCF-7细胞，ALDH1、Oct-4表达下调，E-cadherin、Vimentin表达上调；成纤维细胞上清液培养的原代细胞中ALDH1表达下调，E-cadherin、Vimentin表达上调。提示本实验培养的微球体可能具有干细胞的特性，而成纤维细胞上清液中的一些生长因子或趋化因子如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、基质衍生因子-1（stroma derived factor-1，SDF-1）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），以直接或间接的方式与乳腺癌细胞本身及炎细胞、内皮细胞等相互作用，促进了BCSCs的分化。本研究不足之处为尽管无血清悬浮培养能够纯化BCSCs，但所形成的微球体可能并非全是真正意义上的BCSCs。随着研究的不断深入，有望发现更为有效的筛选并纯化BCSCs的方法。

肿瘤微环境是细胞外基质、血管内皮细胞、纤维母细胞及炎症细胞等在肿瘤发展过程中形成的局部稳态环境，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。Sneddon等［11］研究表明，如骨形态蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)拮抗剂Gremlin1蛋白，能够阻止基底细胞癌的分化。肿瘤相关成纤维细胞（tumor-associated fibroblasts，TAFs）高表达Gremlin1蛋白，在一定程度上解释了TAFs分泌的Gremlin1蛋白或许能够促进肿瘤干细胞（tumor stem cells，CSCs）的自我更新和分化能力。本研究中MTT比色法检测发现，使用成纤维细胞上清液培养的原代细胞及MCF-7细胞的生长速度均快于无血清培养液PCM-2的培养，差异具有统计学意义（P＜0.05），再次证实了成纤维细胞上清液中的成纤维细胞可能通过其分泌的大量相关生长因子影响乳腺癌细胞的生物学活性。Römer等［12］研究发现原代乳腺癌细胞与正常乳腺组织中的成纤维细胞在三维培养后出现恶性表型的逆转，而具体机制尚待进一步研究。Polyak等［13］提出上皮细胞与肿瘤微环境之间相互作用，能够调节上皮细胞的分化、增殖、浸润及迁移。Korkaya等［14］研究证实TAFs能够通过分泌白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、趋化因子CXCL-7等，激活BCSCs的STAT3/NF-κB信号通路，引发BCSCs的自我更新和多向分化的潜能。Orimo等［15］将TAFs与乳腺癌细胞共培养后植入免疫缺陷小鼠体内，肿瘤生长速度明显加快。推测TAFs分泌的SDF-1、TGF-β、bFGF等因子诱导刺激上皮细胞，促进乳腺癌细胞的生长、增殖及分化。

综上所述，本研究通过无血清悬浮培养富集了BCSCs样微球体。BCSCs具有增殖和多向分化的能力，乳腺癌细胞本身产生的细胞因子和生长因子能够增强BCSCs样微球体的增殖能力，并且成纤维细胞上清液中分泌的一些生长因子及趋化因子在一定程度上也促进了BCSCs样微球体的增殖与分化。肿瘤微环境在调节乳腺癌细胞生长、介导致瘤效应的过程中发挥了至关重要的作用。肿瘤微环境可以影响BCSCs样微球体的生存状态，但BCSCs是否能够在微环境中促进肿瘤致瘤性，尚待进一步研究。

1 Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12)： 2893-2917.

2 Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(7)：3983-3988.

3 Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J].Cell Stem Cell,2007,1(5)：555-567.

4 Nagy JA,Chang SH,Shih SC,et al.Heterogeneity of the tumor vasculature[J].Semin Thromb Hemost,2010,36(3)：321-331.

5 Mantel PY,Schmidt-Weber CB.Transforming growth factor-beta：recent advances on its role in immune tolerance[J].Methods Mol Biol,2011,677：303-338.

6 Kalluri R,Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J].J Clin Invest,2009,119(6)：1420-1428.

7 Lengerke C,Fehm T,Kurth R,et al.Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma[J].BMC Cancer,2011,11：42.

8 Debeb BG,Xu W,Mok H,et al.Differential radiosensitizing effect of valproic acid in differentiation versus self-renewal promoting culture conditions[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2010,76(3)：889-895.

9 Ricardo S,Vieira AF,Gerhard R,et al.Breast cancer stem cell markers CD44,CD24 and ALDH1：expression distribution within intrinsic molecular subtype[J].J Clin Pathol,2011,64(11)：937-946.

10 Xing F,Saidou J,Watabe K.Cancer associated fibroblasts(CAFs) in tumor microenvironment[J].Front Biosci(Landmark Ed),2010, 15：166-179.

11 Sneddon JB,Zhen HH,Montgomery K,et al.Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(40)：14842-14847.

12 Römer AM,Lühr I,Klein A,et al.Normal mammary fibroblasts induce reversion of the malignant phenotype in human primary breast cancer[J].Anticancer Res,2013,33(4)：1525-1536.

13 Polyak K,Kalluri R.The role of the microenvironment in mammary gland development and cancer[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(11)：a003244.

14 Korkaya H,Liu S,Wicha MS.Breast cancer stem cells,cytokine networks,and the tumor microenvironment[J].J Clin Invest,2011,121 (10)：3804-3809.

15 Orimo A,Gupta PB,Sgroi DC,et al.Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion[J].Cell,2005, 121(3)：335-348.

（2014-06-24收稿）

（2014-09-25修回）

Influence of tumor microenvironment on culture and identification of breast cancer stem cell-like microspheres

Yufen ZHU,Meijing REN,Feng Gu,Li Fu

Li Fu;Email:fulijyb@hotmail.com
Department of Breast Cancer Pathology and Research Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center of Cancer,Ministry of Education Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30930038)

Objective:To investigate the influence and significance of tumor microenvironment in breast cancer stem-cell culture and identification.Methods:Cells isolated from primary breast cancer tissues were cultured in vitro in a serum-free medium PCM-2 and in the supernatant of cultured fibroblasts.The MCF-7 breast cancer cell line was used as the control group.The status of the microspheres was observed,and the proliferative capacity of the cells was detected by methyl thiazolyl tetrazolium assay.The expression of stem cell and epithelial-mesenchymal markers were detected by real-time reverse transcription polymerase chain reaction.Results:The diameter of microspheres in PCM-2 gradually increased with prolonged incubation time(t=4.996,P=0.002).The cells in the supernatant of cultured fibroblasts increased daily and mostly exhibited a spindle cell growth.The growth rate of primary breast cancer cells was faster in the supernatant of cultured fibroblasts than in PCM-2(P=0.004).Compared with the case of cells in the supernatant of cultured fibroblasts,aldehyde dehydrogenase 1 was upregulated in the primary breast cancer cells cultured in serum-free medium PCM-2, whereas E-cadherin and Vimentin were downregulated.Conclusion:Serum-free culture can be one of the best methods for enriching breast cancer stem cell-like mammospheres.The tumor micro-environment serves a vital function in the growth and development of tumor cells and in the evolution of breast cancer.

breast cancer,breast cancer stem cells,tumor microenvironment,serum-free culture,mammospheres

10.3969/j.issn.1000-8179.20141062

天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室（天津市300060）

*本文课题受国家自然科学基金重点项目（编号：30930038）资助

付丽 fulijyb@hotmail.com

朱玉芬 专业方向为肿瘤微环境与乳腺癌生长侵袭转移机制等。

E-mail：zhuyufenrain@163.com