三种抗酸染色法检测痰结核分枝杆菌结果分析

郑 浩，柳晓金，齐海亮，冯建纯，朱桂云，郑立恒

(1河北省胸科医院 功能科，河北 石家庄 050000；2.石家庄市第五医院 检验科，河北 石家庄 050000)

结核病是全世界成人因传染病死亡的主要疾病之一。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者数量居世界第2位，仅次于印度。痰液抗酸染色镜检发现抗酸杆菌是肺结核确诊的最基本方法，也是发现传染源、选择用药方案、考核疗效、随访病情的重要手段，在肺结核病治疗和控制中占有非常重要的地位[1]。本文应用涂片法、漂浮集菌法和夹层杯法三种抗酸染色法对怀疑肺结核患者的痰液进行检测并讨论它们对于诊断肺结核的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 1 500例痰标本来自2012年1～12月病房和门诊高度怀疑肺结核的患者。患者男828例，女672例，年龄11～76岁，平均(39.8±7.3)岁。标本为患者从肺深部咳出的晨痰留于一次性塑料瓶内和夹层杯内。

1.2 主要试剂和仪器 TQ-12自动离心涂片机、振荡器、生物安全柜(美国NUAIRE)、夹层杯、恒温干片机、消化灭活液、抗酸染色液、显微镜(日本奥林巴斯)。

1.3 方法

1.3.1 涂片法 严格按照《痰涂片镜检质量保证手册》将患者留取的痰首先做直接涂片、干燥[2]，抗酸染色后镜检。

1.3.2 漂浮集菌法 将患者痰标本加适量无菌蒸馏水，放入121 ℃高压蒸汽锅灭菌30 min，加入二甲苯适量，置振荡器上震荡10 min左右，待混合均匀，取出后加蒸馏水至瓶口，静置15 min，取载玻片(血清处理以增加粘附力)盖于瓶口，静置15 min，取下玻片，干燥后抗酸染色。

1.3.3 夹层杯法 湖南怀化天骑医学新技术有限公司提供夹层杯法配套仪器和试剂。将痰消化液加入装有3～5 ml痰液的彭氏杯中，在振荡器上混匀5 min，待消化完全，放入烤片箱内灭活结核菌15 min，置于离心涂片机上，4 000 r/min，离心 8 min，倒掉上清液，按说明书要求进行抗酸染色，自然干燥或烘干后，用取片针顶出夹层片，使涂菌面朝下，置载玻片上，用中性树胶粘牢，油镜镜检。

1.4 统计学方法 用SPSS 13.0软件对数据进行分析，三种方法间的比较用两两配对的卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测结果 1 500份标本分别用三种方法进行检测，涂片法阳性份数244份，漂浮集菌法330份阳性，夹层杯法336例阳性。

2.2 三种检测方法的比较 涂片法与漂浮集菌法比较差异有统计学意义，漂浮集菌法的阳性检出率较高(配对χ2=78.68，P<0.001，表1)；涂片法和夹层杯法的差异有统计学意义，夹层杯法的阳性检出率高(配对χ2=86.37，P<0.001，表2)；漂浮集菌法和夹层杯法检测差异无统计学意义(配对χ2=2.50，P>0.05，表3)。

表1 涂片法与漂浮集菌法检测结果比较

表2 涂片法与夹层杯法检测结果比较

表3 漂浮集菌法与夹层杯法检测结果比较

3 讨论

肺结核的细菌学实验室诊断一直是国内外研究的重要课题[3]。痰培养和涂片抗酸染色发现结核菌是诊断肺结核的金标准。但是结核菌培养比较复杂和昂贵，所需时间较长，一般在4～8周左右，在贫困的地区难以普及和推广。涂片法是抗酸菌病原学检测方法中最经济、快捷、有效的方法，但是其敏感性低，只有大于5 000条菌/ml的痰液才能检测到抗酸菌。

近些年发明的漂浮集菌法和夹层杯法，通过浓缩在痰液中分散的结核菌来提高结核菌的检出率。漂浮集菌法先把痰液进行高压灭菌，再加消化液震荡使结核菌分散开来，利用结核菌的密度小于消化液密度的特点，通过结核菌漂浮于液体表面来达到集菌的目的。夹层杯法使用特制的消化液破坏痰液中的蛋白，并高速震荡，使痰液中聚集的结核菌分散开来而有利于通过高速离心沉淀于夹层杯底部的薄膜上以达到集菌的目的，再进行抗酸染色及镜检。此研究的结果是漂浮集菌法和夹层杯法检测结果无统计学差异，夹层杯的阳性检出率稍高一些。前者检测过程难以标准化，操作费时、繁琐，高压灭菌时间长，漂浮到液面的结核菌也不能保证完全粘附在玻片上，易造成污染，且受操作者的主观影响因素较多，假阳性、假阴性的几率较高。而后者易于标准化，操作安全、简便，整个实验在2 h内完成，且痰标本操作在夹层杯中进行，减少了标本暴露，在制作烤片过程中，60 ℃ 20 min可有效杀灭结核菌，有效提高了实验室生物安全水平，通过离心结核菌完全直接沉淀到薄膜上，标本用树脂封存于载玻片上，避免了交叉污染，阳性率也得以提高[4-6]。

综上所述，涂片法阳性率低，给一些肺结核患者的诊断带来一定困难；漂浮集菌法步骤繁琐，不易于标准化，应用受到限制；而夹层杯法易于标准化、安全性高、高效、便捷，较涂片法阳性率高，值得适当推广。

【参考文献】

[1] 徐宁.痰中结核杆菌的检测方法及临床意义[J].临床肺科杂志,2009,14(4):536.

[2] 中国疾病预防控制中心.痰涂片镜检质量保证手册[M].北京:中国协和医科大学出版社,2004:12-13.

[3] 陈中秀，谢清波，周凤荣.聚集沉淀涂片与直接涂片抗酸染色法检测抗酸杆菌的应用比较[J].中国防痨杂志,2009,31(4):225-226.

[4] 王淑侠，刘成永，闫家微，等.夹层杯离心涂片集菌法快速检测抗酸杆菌临床应用的初步观察[J].中国防痨杂志,2009,31(9):535-537.

[5] 杨华林，谭云洪，白丽琼，等.液基夹层杯技术检测抗酸杆菌应用性研究[J].中国防痨杂志,2011,33(5):279-282.

[6] 王改，曹青山，王金绳，等.夹层杯集菌离心涂片法检测痰抗酸杆菌对肺结核诊断价值的研究[J].中国民康医学,2007,19(8):614.