人附睾分泌蛋白4在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义

石少凤，田德明，黄文斌，怀建国，王劲松

(1.芜湖市第一人民医院 妇产科,安徽 芜湖 241000；2.芜湖市第一人民医院 病理科,安徽 芜湖 241000；3.南京市第一医院 病理科，江苏 南京 210006)

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率虽然低于子宫颈癌和子宫内膜癌，但病死率却居妇科恶性肿瘤的首位[1]。大多数卵巢癌患者出现临床症状时已处于进展期，而早期却没有特异性临床诊断标记物，因而开发新的卵巢癌诊断标记物是早期发现和诊断卵巢癌的重要措施。人附睾分泌蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)是近年来发现的一种新的卵巢癌早期诊断的标志物，与CA125联合检测是提高卵巢癌的诊断率，监测术后治疗效果以及预测是否复发的重要指标[2-4]。然而，目前国内外关于HE4与卵巢癌的研究，大多集中于血清学检测，而在卵巢癌组织中的研究相对较少。本文应用免疫组化EnVision法检测卵巢上皮性良恶性肿瘤中HE4表达，探讨HE4在卵巢癌中的表达及其临床意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集芜湖市第一人民医院病理科和南京市第一医院病理科2009年1月～2013年9月间经病理确诊的卵巢良性、交界性和恶性上皮性肿瘤存档蜡块共90例。其中卵巢上皮性良性肿瘤20例(浆液性囊腺瘤和黏液性囊腺瘤各10例)、交界性肿瘤15例(浆液性交界性肿瘤10例、黏液性交界性肿瘤5例)和恶性上皮性肿瘤55例(浆液性癌25例、子宫内膜样腺癌15例、透明细胞癌10例和黏液性腺癌5例)。55例卵巢癌根据FIGO进行临床分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期7例；有淋巴结转移7例，无淋巴结转移48例。所有病例术前均未行放疗和化疗。

1.2 试剂 兔抗人HE4多克隆抗体为英国Abcam公司产品，抗体稀释度为1∶40，购自厦门泉辉生物有限公司。EnVision检测试剂盒为美国Dako公司产品，购自南京大鸟科技有限公司。DAB显色液购自福建迈新生物公司。

1.3 免疫组织化学方法 所有标本均采用10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片后行免疫组化染色。免疫组化采用EnVision法，切片脱蜡、梯度酒精脱水后，3%过氧化氢灭活内源性生物素酶，高压锅高温高压抗原修复，抗原修复液为枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)，滴加一抗，4 ℃冰箱内孵育过夜；滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，镜下观察。以附睾组织作为HE4阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断 HE4免疫组化阳性表达为肿瘤上皮细胞质内出现黄色颗粒状信号。HE4阳性结果的评价根据染色强度和阳性细胞百分比采用二次计分法进行评分。先根据HE4阳性信号强度进行打分，即阴性为0分、淡黄色为1分、黄色为2分、棕黄色为3分；然后观察整个切片，根据阳性细胞百分比进行打分，0分为阴性、阳性细胞数≤10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。上述二者评分的乘积作为最终积分，积分≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，HE4表达与临床病理指标之间的关系采用χ2检验或Fisher精确概率法。

2 结果

2.1 HE4在良性、交界性和恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达 HE4阳性信号位于肿瘤性上皮的细胞质(图1)。由表1可知，HE4在卵巢癌中的阳性表达率为83.6%(46/55)，明显高于交界性肿瘤(53.3%，8/15)和良性肿瘤(15.0%，3/20)，差异有统计学意义(P=0.032；χ2=30.507，P<0.01)。卵巢交界性肿瘤中HE4表达高于良性肿瘤，二者差异有统计学意义(P=0.027)。

A：HE4在卵巢良性上皮性肿瘤中表达阴性；B：HE4在卵巢交界性上皮性肿瘤中表达阳性；C：HE4在卵巢恶性上皮性肿瘤中表达阳性

图1 HE4在卵巢良性、交界性和恶性上皮性肿瘤中的表达(Envision×400)

表1 HE4在良性、交界性和恶性上皮性肿瘤中的表达

2.2 HE4在卵巢上皮性肿瘤中的表达分布 由表2可知，在卵巢良性和交界性上皮性肿瘤中，HE4仅见于浆液性肿瘤，而黏液性肿瘤均不表达。卵巢恶性上皮性肿瘤中，HE4主要表达于卵巢浆液性癌和子宫内膜样癌，而黏液性癌仅1例局灶阳性表达，透明细胞癌中HE4表达介于浆液性癌、子宫内膜样癌与黏液性癌之间。

表2 HE4在卵巢上皮性肿瘤的表达分布

2.3 卵巢癌中HE4表达与FIGO分期和淋巴结转移之间的关系 随着卵巢癌FIGO分级提高，HE4阳性表达率也逐渐增高，但差异无统计学意义(P=0.104)。HE4在伴有淋巴结转移的卵巢癌中的表达与不伴有淋巴结转移者比较，差异无统计学意义(P=0.585)。卵巢癌中HE4表达与FIGO分期和淋巴结转移之间的关系见表3。

表3 HE4表达与卵巢癌FIGO分期和淋巴结转移之间的关系

临床病理指标例数HE4表达+-阳性率(%)FIGO分期Ⅰ2821775Ⅱ2018290Ⅲ770100淋巴结转移有770100无4839981 3

3 讨论

HE4首次在人远端附睾上皮中被发现，最初被预测为一种参与精子成熟的蛋白酶抑制因子[5-6]。该基因也称为WFDC2，编码具有一个WAP型4二硫键核心(WFDC)结构域的蛋白。HE4因与WFDC蛋白家族中已知的白细胞蛋白酶抑制因子具有同源性和相当的转录谱，而被认为在天然免疫中也具有作用。HE4与卵巢癌的关系最近得到了较多的研究和重视，与正常卵巢组织相比，HE4在卵巢癌中呈持续的过表达。然而，目前关于HE4和卵巢癌中的相关研究大多集中于血清学方面，而关于组织中HE4表达情况的研究较少。

Drapkin等[7]最早对HE4在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达进行了研究，他们研究发现HE4不表达于卵巢表面上皮，而表达于卵巢包涵囊肿，他们同时研究发现在卵巢外其他正常组织中，HE4可表达于呼吸道上皮，偶尔见于肾近曲小管和涎腺导管上皮，而胃肠道、肝脏、胰腺、脾脏、淋巴结和间叶组织、乳腺和脑组织中不表达。在该研究中，作者们还发现HE4高度表达于卵巢浆液性腺癌和子宫内膜样腺癌中，而在10例黏液性癌中，仅有1例表达，透明细胞癌中HE4表达介于它们之间。Galgano等[8]应用免疫组化结合组织微阵列技术研究了HE4在人类正常和恶性肿瘤组织中的表达，结果显示HE4在女性生殖道正常上皮表达阳性，乳腺上皮中不同程度表达，前列腺、肾小管、支气管、输精管、涎腺、泪腺、汗腺、结肠和胰腺腺泡细胞可有HE4表达。在恶性肿瘤中，HE4主要表达于卵巢浆液性腺癌和子宫内膜样腺癌，而黏液腺癌表达阴性，在非卵巢恶性肿瘤中，HE4主要见于子宫内膜样腺癌和肺腺癌。我们的研究结果也显示，HE4主要表达于卵巢浆液性癌和子宫内膜样癌，而黏液性肿瘤中仅有1例黏液性癌局灶性表达，这些研究结果提示HE4可相对特异性表达于卵巢上皮性恶性肿瘤中，可作为诊断卵巢来源的一个相对比较特异性标记物。由于浆液性肿瘤和子宫内膜样腺癌均属于苗勒上皮来源的肿瘤，我们的研究结果提示HE4表达可能是苗勒上皮来源肿瘤的一个相对特异性标记物，对于临床上手术无法切除的卵巢癌患者，小活检标本中肿瘤细胞表达HE4，结合其他标记物可有助于卵巢癌的组织学分型，从而更好地指导临床治疗。

我们应用免疫组化方法研究了HE4在卵巢良性、交界性和恶性肿瘤中的表达，结果显示HE4在卵巢癌中的表达明显高于良性和交界性肿瘤，交界性肿瘤高于良性肿瘤，差异具有统计学意义。Georgakopoulos等[9]最近研究发现HE4高度表达于恶性卵巢肿瘤和一些良性与交界性卵巢肿瘤中。国内王丹丹等[10]研究结果显示HE4在正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤中不表达或部分表达，在卵巢癌组织中表达明显增高。根据国内外文献结合本文研究结果，提示HE4在早期卵巢癌中表达，大量表达的HE4可能通过EGFR-MAPK信号通路的活化而促进了卵巢上皮细胞的恶性转化[10]。

HE4表达与卵巢癌临床病理指标之间的关系研究中，王丹丹等[11]研究发现早期卵巢癌中HE4表达高于中晚期，中、低分化卵巢癌高于高分化卵巢癌，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者。周留林等[12]研究了卵巢浆液性肿瘤中HE4表达，结果发现HE4表达与卵巢浆液性癌临床分期和淋巴结转移密切相关。郭冰沁等[13]研究结果也显示HE4阳性表达随卵巢癌病理分级增高而增高，临床分期越高，其阳性表达率也越高，且有腹腔扩散或淋巴结转移者卵巢癌中HE4表达明显高于无腹腔扩散和淋巴结转移阴性者。最近周磊等[14]应用RNA干扰技术对HE4干扰后的卵巢癌细胞系的生物学行为进行观察，结果发现HE4干扰所致的HE4表达下调可降低卵巢癌细胞的粘附和侵袭能力，这些研究结果高度提示HE4表达是卵巢癌具有高度侵袭性行为的一个标志。虽然我们的实验结果未能发现HE4表达与卵巢癌临床分期和淋巴结转移有相关性，但我们目前的实验结果显示HE4表达随着临床分期增高而增高，一定程度上提示HE4表达可能反映卵巢癌的临床生物学行为，需待以后扩大病例数进一步分析研究。

总之，我们的研究结果显示HE4主要表达于卵巢浆液性癌和子宫内膜样癌，且在卵巢恶性上皮性肿瘤表达明显高于卵巢交界性和良性上皮性肿瘤，提示HE4不仅是卵巢恶性上皮性肿瘤的一个诊断标记物，还可能是卵巢苗勒管起源的上皮性肿瘤标志物。

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