肺癌细胞裂解物对树突状细胞的免疫抑制作用

董博翰，戴广丽，凌烈锋，吕 俊，孟 宇

(1.皖南医学院 生物化学教研室,安徽 芜湖 241002;2.芜湖市中医医院 妇产科,安徽 芜湖 241000)

树突状细胞疫苗是目前肿瘤免疫学领域研究较多，并且应用前景较好的一类抗肿瘤疫苗。这类疫苗发挥作用的基本原理是：用肿瘤抗原冲击活化肿瘤患者自体树突状细胞(dendritic cell,DC)，然后再将活化后的DC回输患者体内，活化后的DC将肿瘤抗原递呈给T、NK等免疫细胞，免疫细胞被激活后清除肿瘤细胞[1]。

在DC疫苗制备过程中，最常用的冲击活化剂是肿瘤细胞裂解物(tumor cell lyaste,TCL)。这是因为TCL中，含有肿瘤细胞表达的全部肿瘤特异性抗原(tumoe specific antigen,TSA)和肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)，有利于树突状细胞最大限度地呈递肿瘤抗原[2]。但是，利用TCL活化DC的过程中，也会诱导免疫抑制性DC生成，这会损害树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用[3]。常规DC肿瘤疫苗中既含有具有刺激作用的DC亚群，又含有具有诱导免疫耐受作用的DC 亚群，而后者有可能减弱效应性T细胞对TAA 的特异性免疫应答的作用[4]。Yang DH等的研究发现，在骨髓瘤病人使用自体DC疫苗进行治疗时，先要在体外使骨髓瘤TCL同DC共孵育。在这一过程中，TCL会诱生免疫耐受性DC(Tolergenic DC)。而这种DC亚群回输到患者体内后，会导致较低的肿瘤缓解率和较短的生存期[5]。

TCL诱生抑制性树突状细胞，同其成分特性有关。TCL是肿瘤细胞被人为破裂后形成的混合物，其成分中必然含有一些肿瘤细胞表达的免疫抑制物质，因此会对DC产生抑制作用[6]。而在肿瘤细胞所表达的免疫抑制物中，透明质酸(Hyaluronan,HA)具有明确的诱导抑制性DC生成作用。Kung DM等的研究发现，人白血病Hela细胞的培养上清液中含有HA，将其作用于人DC后，DC会转化成耐受性DC。这种抑制性免疫细胞可以显著下调CD4+ T淋巴细胞的活性，产生免疫抑制作用[7]。由于肿瘤细胞培养上清液中的物质，都是肿瘤细胞合成后分泌的，因此用肿瘤细胞制备的TCL中，应该含有透明质酸。

在本研究中我们将检测Lewis肺癌细胞 TCL中HA的存在情况及含量，并在体外提取、培养C57/BL6小鼠DC，然后研究TCL中的HA诱导抑制性小鼠DC生成的作用。以此，为TCL冲击活化DC过程的改良打下理论方面的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 TCL利用反复冻融的方法制备。DMEM细胞培养液购于武汉博士德生物工程有限公司。FITC标记的抗鼠CD86单克隆抗体、anti-CD44单克隆抗体购于美国BD公司。HA、IL-10、IL-12检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。LPS购于江苏碧云天生物技术有限公司。实验所用的其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.2 实验动物 实验用C57/BL6小鼠，雌性，6～8周龄，购于南京青龙山动物繁殖场。

1.1.3 实验细胞 C57/BL6小鼠来源的Lewis肺癌细胞株购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.4 实验仪器 酶标检测仪购于芬兰Thermo公司。流式细胞检测仪购于美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Lewis肺癌细胞来源的TCL的制备 在本研究中我们采用反复冻融的方法制备Lewis肺癌细胞来源的TCL。过程如下：取Lewis肺癌细胞溶于生理盐水中，分别在-80℃和37℃条件下反复冻融细胞溶液5次，其中-80℃冻15 min、37℃融5 min，然后用台盼蓝染色的方法检测细胞冻融破裂情况。接下来，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞内蛋白释放，并同细胞裂解液裂解后的TCL进行对比，以评估反复冻融法制备TCL的优劣。

1.2.2 C57/BL6小鼠DC的分离、诱导及培养 颈椎脱臼处死小鼠，无菌取双侧股骨和胫骨，用自制的GKN缓冲液(NaCl 8 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·2H2O 0.69 g，葡萄糖2 g，酚红0.01 g，溶于1 L双蒸水中，以稳定悬浮细胞)冲洗出骨髓，制成细胞悬液，清洗后1∶10的体积比加入37 ℃预温的红细胞裂解液,反复吹打混匀,室温，2～4 min,加GKN 10 ml终止反应，离心洗涤后，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为 2×109/L，接种于6孔培样板，每孔2 ml，加入细胞因子mrGM-CSF,IL-4 各20 μg/L隔天半量换液。6 d后,在相差显微镜下观察DC成熟情况，并收集DC，以抗CD86抗体对树突状细胞进行染色，然后利用流式细胞检测仪检测DC表面CD86细胞表面分子的表达情况。

1.2.3 ELISA检测TCL中HA含量 取1×106Lewis肺癌细胞，按上述反复冻融法制备TCL。然后，用小鼠HA 酶联免疫吸附检测试剂盒检测TCL中的HA。根据试剂盒中HA标准品在450 nm的吸光值，使用Curve 1.0软件绘制标准曲线图。按标准曲线图，查找求得TCL中HA的浓度。

1.2.4 TCL诱导免疫抑制性DC生成 取2只C57/BL6小鼠，分别在体外提取每只小鼠DC，将提取的树突状细胞同制备好的TCL进行共孵育，同时设立生理盐水对照组。每1×105DC同1×106Lewis细胞制备的TCL共孵育。培养第6天,于细胞培养孔中加入LPS,终浓度为200 ng/ml。于DC培养后，第5、6、7、8天收集树突状细胞，用ELISA的方法检测上清液中IL-12、IL-10分泌水平。根据不同时间点的细胞因子分泌量，绘制细胞因子分泌趋势直方图，分析TCL对DC分泌细胞因子的影响。我们用终浓度10 μg/ml的抗CD44抗体(Pep-1)作用于TCL和DC 的共培养孔，并设立生理盐水对照组。然后，按上述时间点和方法检测细胞培养上清液中IL-12和IL-10的分泌水平，绘制细胞因子分泌趋势直方图，分析TCL中HA对DC分泌细胞因子的影响。该实验共进行了2次。

1.2.5 统计学分析 所有实验数据使用单因素差异分析法来进行分析。对于方差齐的两样本均数，采用双尾t检验来进行比较。对于方差不齐的两样本均数，采用秩和检验来进行比较。当P<0.05时认为有统计学差异。

2 结果

2.1 以Lewis肺癌细胞制备出TCL 将1×106Lewis肺癌细胞，经-80℃和37℃反复冻融处理后，在显微镜下我们观察到：所有的Lewis肺癌细胞都已经失去了正常的细胞形态，并被台盼蓝溶液蓝染。这说明反复冻融后全部Lewis肺癌细胞都已经死亡，从形态上看，细胞已经变形、破裂(图1A)。而SDS-PAGE电泳结果上可以观察到弥散的蛋白条带。这进一步说明，反复冻融的处理过程已经使Lewis肺癌细胞的细胞膜完全破裂，细胞内物质释放形成TCL(图1B)。此外，反复冻融制备的TCL形成的条带，明显深于细胞裂解液处理制备的TCL形成的条带。这说明反复冻融法能更好地破裂细胞、制备TCL。

A：显微镜下观察TCL(200×)；B：聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定TCL。1:化学裂解法制备的TCL上清液,2:反复冻融法制备的TCL上清液,3：化学裂解法制备的TCL全溶液,4:反复冻融法制备的TCL全溶液

图1 Lewis肺癌细胞TCL制备

Fig 1 Preparation of TCL using Lewis lung cancer cells

2.2 提取C57/BL6小鼠DC，于体外细胞因子诱导其成熟 冲洗C57/BL6小鼠骨髓腔获得的DC，GM-CSF和IL-4处理6 d后，在显微镜下观察：细胞呈典型DC形态，具多形性，贴壁时有细长突起，呈“树突状”，悬浮时向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，呈“刺猬状”，部分伸展为不规则状(图2 A)。将具有该形态的细胞收集后进行流式检测，结果显示：同没经GM-CSF作用的对照组细胞相比，呈“树突状”或“刺猬状”的DC表面，CD86表达明显上调，表达率为61.35%(图2 B)。这进一步说明，DC已经诱导成熟。

A：显微镜下观察DC形态(400×)；B：成熟DC的CD86表面分子流式检测。B上图：未加GM-CSF、IL-4处理的DC,B下图：GM-CSF、IL-4处理6 d后的DC

图2 小鼠DC的体外培养

Fig 2 Mouse DCs culturedinvitro

2.3 Lewis肺癌细胞TCL中存在高浓度HA 经ELISA检测，Lewis肺癌细胞制备的TCL中确实存在HA，而制备TCL的溶剂生理盐水中不含HA。这证明TCL中的HA来源于Lewis肺癌细胞本身。经过同鼠源性HA标准品绘制的标准曲线进行比对，我们确定TCL中HA的含量为42 mg/ml(图3)。

A：ELISA检测TCL中HA，其中1：NaCl溶液，2～6：不同浓度HA标准品，7：TCL。B：根据HA标准品检测OD值绘制的标准曲线及根据标准曲线查得的HA含量

图3 TCL中HA含量检测

Fig 3 HA level detected in the TCL

2.4 Lewis肺癌细胞TCL中HA能诱导抑制性DC生成 将1×106Lewis肺癌细胞制备的TCL同细胞因子GM-CSF和IL-4共同作用于小鼠DC，培养第6天加LPS，于第5、6、7、8天检测细胞培养上清液中细胞因子含量，我们发现：同NaCl对照组相比，TCL作用后的第7、8天，DC在LPS刺激之下，IL-12的分泌水平显著减弱(P<0.01)。而DC分泌IL-10的能力则从TCL作用后第5天显著增强(P<0.01)，并具有时间依赖性(图4A)。 而当我们用抗HA受体-CD44的单克隆抗体(Pep-1)，抑制HA同CD44的结合以后，再将TCL作用于DC。此时，DC的IL-12和IL-10分泌，均在TCL作用后的第7、8天(培养体系中加入LPS后)才出现增加。在各时间点上，同生理盐水组相比没有差异(P>0.05，图4B)。

图4 TCL通过HA诱生耐受性DC

Fig 4 Immunocompetence of DC activated by HA in the TCL

3 讨论

用TCL冲击活化DC，是DC疫苗制备过程中的关键步骤。但TCL成分复杂，因此在活化DC的同时也会诱导抑制性DC产生[8]。究竟是TCL中的哪些物质可能诱导抑制性DC生成，目前知之甚少。在本研究中，我们对TCL中HA对DC的抑制作用进行了探索。

HA是一种细胞基质成分，人肺癌细胞95D、肝癌细胞HepG2等9种肿瘤细胞都能够表达HA，并且这些细胞培养上清液中的HA可以在体外诱导免疫抑制性的单核巨噬细胞和DC生成[9]。此外，使用免疫组化的方法，人们也在乳腺癌和胃癌中发现HA可在癌细胞原位表达。因此，冲击DC所用的TCL中应该含有HA[10-11]。

对于TCL的制备，目前常用的方法有化学裂解法、紫外照射法等[12]。而本研究采用的是反复冻融法，该方法能最大限度地使肿瘤细胞破裂，以释放细胞内全部成分，并能使细胞释放出的内容物(蛋白、小分子化合物、核酸等)的分子结构得以维持，不会受到外来化学试剂或者射线的破坏。从我们制备TCL的结果来看：反复冻融法可以使全部Lewis肺癌细胞发生死亡破裂。并且，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可以看出：反复冻融法TCL中蛋白浓度，大于化学裂解法TCL中蛋白浓度，这说明反复冻融法能使细胞内物质最大限度地释放。不过，这样的结论需要对蛋白定量检测，才能给予明确验证。

对于体外培养的DC，在本研究中，我们选择了C57/BL6小鼠DC。这是因为制备TCL的Lewis肺癌细胞是一种来源于C57/BL6小鼠的细胞株，只有TCL来源相同，才符合自体DC疫苗的制备原则。而这种C57/BL6小鼠DC体外诱导培养成功与否，主要依赖于显微镜下观察细胞形态和DC细胞表面分子的流式检测。其中镜下观察DC成熟的依据是：成熟的DC会呈半贴壁或者悬浮状态生长[13]，贴壁DC会在细胞边缘伸出形状不规则的“刺状”突起，而悬浮细胞则呈圆形，细胞边缘有模糊的“毛刺”。本研究中，我们用IL-4和GM-CSF诱导培养第6天后的C57/BL6小鼠DC符合这种形态特点。并且流式检测的结果证明，这些DC细胞表面的CD86分子，同未经细胞因子处理的细胞相比，表达明显增加。这符合成熟DC的CD86细胞表面分子会出现上调的特点。

我们用ELISA的方法检测出，1×106Lewis 肺癌细胞制备的TCL中HA的含量为42 mg/ml。Kuang DM等人曾经发现50 μg/ml的HA即可以诱导巨噬细胞转化成为抑制性巨噬细胞。而我们制备的TCL中HA的含量远高于这一浓度。这可能同TCL中HA的片段长度多样性有关。肿瘤细胞可以合成小片段、中等长度以及高分子量等不同长度的HA，其中高分子量的HA合成量较大，但只有小片段和中等长度的HA能诱导抑制性免疫细胞生成[9]。TCL中尽管HA浓度较高，但绝大多数都是高分子量HA，小片段和中等长度的HA的浓度应该远低于42 mg/ml，但应该高于50 μg/ml。而接下来的研究我们也证明了TCL中是存在可以诱导抑制性免疫细胞生成的小片段和中等长度HA的。

当我们将TCL同DC一起共孵育培养时，DC在LPS刺激下分泌IL-12的能力出现了显著下降，而分泌IL-10的能力则出现了显著升高。IL-12被认为是一种免疫刺激性细胞因子，IL-10则是公认的抑制性细胞因子。IL-12可以同IL-2一起协同促进细胞免疫应答，IL-10则对单核细胞、CD4+T细胞、NK细胞等多种免疫细胞具有抑制作用。因此，DC分泌IL-12减少、分泌IL-10增加，是一种典型的DC向免疫抑制性DC转化的表现。当用特异性抗体封闭了HA在DC上的受体CD44分子后，DC又重新转变回在LPS刺激下IL-12分泌增加而IL-10分泌减少的状态。抑制T细胞功能的免疫耐受性DC，具有低分泌IL-12、高分泌IL-10的特点[9]。这种转变的发生可能是TCL中小片段和中等长度HA在发挥作用。这种转化不利于TCL更好地冲击活化DC，也不利于DC回输机体后诱导抗肿瘤免疫的发生。因此，在制备DC疫苗的过程中，应考虑先去除TCL中的HA，再对DC进行冲击活化，以提高DC疫苗的抗肿瘤效力。

【参考文献】

[1] STRIOGA MM1,FELZMANN T,POWELL DJ JR,etal.Therapeutic dendriticcell-based cancer vaccines:the state of the art [J].Crit Rev Immunol,2013,33(6):489-547.

[2] REYES D,SALAZAR L,ESPINOZA E,etal.Tumour cell lysate-loaded dendritic cell vaccine induces biochemical and memory immune response in castration-resistant prostate cancer patients[J].Br J Cancer,2013,109(6):1488-1497.

[3] MAMORU K,HIROSHI T.Intradermal immunization with combined baculovirus and tumor cell lysate induces effective antitumor immunity in mice[J].INTER J OF ONCO,2013,43:2023-2030.

[4] 徐榕，江虹虹，宋海峰.树突状细胞疫苗研究的新策略[J].中国肿瘤,2011,20(2):92-97.

[5] Yang Deok-Hwon, Park Jung-Sun, Jin Chun-Ji,etal.The dysfunction and abnormal signaling pathway of dendritic cells loaded by tumor antigen can be overcome by neutralizing VEGF in multiple myeloma [J].Leuk Res,2009,33(5):665-670.

[6] 董博翰,戴广丽,徐蕾，等.MHSP65-TCL抗黑色素瘤疫苗对免疫细胞活性的影响 [J].南方医科大学学报，2013,33(11)：1673-1677.

[7] KUANG Dongming,ZHAO Qiyi,XU Jing,etal.Tumor-Educated Tolerogenic Dendritic Cells Induce CD3 e Down-Regulation and Apoptosis of T Cells through Oxygen-Dependent Pathways[J].J Immunol,2008,181:3089-3098.

[8] JACKSON AM,MULCATHY LA,ZHU Xingwu,etal.Tumor-mediated disruption of dendritic cell function:inhibiting the MEK1/2-p44/42 axis restores IL-12 production and Th1-generation [J].Int J Cancer,2008,123:623-632.

[9] KUANG Dongming,WU Yan,CHEN Nini,etal.Tumor-derived hyaluronan induces formation of immunosuppressive macrophages through transient early activation of monocytes [J].Blood,2007,110:587-595.

[10] ANTTILA MA,TAMMI RH,TAMMI MI,etal.High levels of stromal hyaluronan predict poor disease outcome in epithelial ovarian cancer [J].Cancer Res,2000,60:150-155.

[11] AUVINEN P,TAMMI R,PARKKINEN J,etal.Hyaluronan in peritumoral stroma and malignant cells associates with breast cancer spreading and predicts survival [J].Am J Pathol,2000,156:529-536.

[12] 董博翰.肿瘤细胞裂解物-结核分枝杆菌热休克蛋白65的抗肺癌作用[D].长春：吉林大学,2009.

[13] 赵丽波,李才,周维国.树突状细胞负载的肿瘤抗原肽疫苗抗脑胶质瘤作用的实验研究 [J].中国实验诊断学,2009,13(1):21-23.