柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达

王志宏+丁莹莹+冯娇娇+李连青+潘卫+郭存九

[摘要] 目的 构建重组质粒柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）VP1，并进行原核表达及鉴定。方法 用PCR方法扩增CA16 VP1序列，构建其重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，并转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）进行诱导表达及纯化，SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物，间接ELISA方法检测重组蛋白CA16 VP1的抗原性和有效性。结果 成功原核表达并纯化了CA16 VP1蛋白，可与小鼠抗CA16病毒血清特异性结合，与太原市老年人群中部分血清存在高反应性。 结论 CA16 VP1蛋白获得成功表达，ELISA检测具有良好的抗原性和有效性，为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。

[关键词] 柯萨奇病毒A组16型；VP1蛋白；原核表达；酶联免疫吸附

[中图分类号] R373.2；R392-33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）14-0069-04

手足口病（Hand foot and mouth disease，HFMD）是一种全球性的传染病，自1957年新西兰首次报道以来[1]，世界各地均有不同程度的流行[2-5]。近年来，手足口病疫情呈不断上升的趋势，尤其在亚太地区。2008年，我国将其列为法定丙类传染病进行监测，目前 HFMD的发病率和死亡率在丙类传染病中仍居首位。引起HFMD的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）和EV71最为常见[6]，其他肠道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。CA16 基因组全长7410 bp，其中VP1基因长891 bp，编码297个氨基酸残基[8]，CA16 VP1含有许多线性中和表位，VP1基因与肠道病毒血清型完全对应，可作为肠道病毒属内不同血清分类依据，也可作为小RNA病毒科分类依据[9]。因此，CA16 VP1基因已成为研究CA16的重要对象。本实验旨在构建pET21b-CA16 VP1重组表达质粒，在大肠杆菌中原核表达并纯化CA16 VP1重组蛋白，并检测其抗原性和有效性，为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、细胞、病毒及试剂

原核表达载体pET21b购自Novagen公司，大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）和Top10菌株购自TAKARA公司。CA16病毒和RD细胞由上海市疾病预防控制中心提供。限制性核酸内切酶BamH I、HindIII和DNA Marker（DL2000）购自宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA 聚合酶试剂盒购自天根生化科技有限公司；T4 DNA连接酶（Ligation High kit）购自东洋纺（中国上海）生物科技有限公司；PCR小量胶回收试剂盒购自北京天恩泽科技有限公司。金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）购自德国QIAGEN公司。重组质粒pET32a-CA16 VP1、纯化的pET32a蛋白和LD5由第二军医大学病原生物学教研室制备并保存，其中LD5为一种新型免疫球蛋白结合分子（NEIBM），可与Ig的VH3和Vk区域双结合，与IgG有较高的亲和力[10-12]。

1.2 实验动物及血清标本

清洁级BALB/C小鼠，雌性，6周龄，16～18 g，由第二军医大学实验动物中心提供；2013年5月29日～5月30日山西医科大学第二附属医院检验科95份太原市老年人血清，其中男48例，女47例，平均年龄（61.0±14.0）岁。

1.3 引物的设计及合成

根据CA16 VP1基因（NCBI 登录号：AEO12126.1）序列自行设计引物，上游P1：5′-GGCCCGGGGATCCGGGTGACCCGATCGCTGAC-3′（下划线部分为BamH I酶切位点），下游P2：5′-CGCCCGCGGAAGCTTCAGAGTAGTGATTTTGTC-3′（下划线部分为Hind III酶切位点），扩增片段大小为891 bp。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.4 CA16 VP1基因的扩增

以pET32a-CA16 VP1质粒为模板，P1、P2为上下游引物，PCR扩增CA16 VP1基因， PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；4℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃ 延伸10 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

1.5 重组表达质粒的构建

将试剂盒回收的PCR产物和表达载体pET21b用BamH I和Hind III双酶切，回收目的基因片段和载体片段，以T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化到感受态E.coliTOP10中，过夜培养后挑取单克隆菌落，37℃摇菌16 h后提取质粒，用BamH I和Hind III双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送上海杰李生物技术有限公司测序。

1.6 重组蛋白的表达

将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）中，挑取单克隆菌落，接种于2 mL LB（100 μg/mL Amp+15μg/ mL Kana）培养基中，37℃培养7 h，按1%接种量接种到50 mL LB培养基中，37℃、230 rpm振荡培养过夜；将50 mL过夜菌液转接至新鲜的450 mL LB中，37℃、230 rpm振荡培养至A600为0.6，加IPTG 至终浓度为1 mmol/L，诱导4 h，离心收集细菌沉淀，在冰浴的条件下超声300次，每次超声3 s，间隔3 s；离心收集上清和沉淀，进行12% SDS-PAGE分析。

1.7 重组蛋白的纯化endprint

取重组菌破菌沉淀，加8 mol/L（pH8.0）尿素10 mL重悬，4℃裂解过夜；离心收集上清用于纯化，纯化按Qiagen公司Ni-NTA说明书进行。12% SDS-PAGE分析，BandScan软件分析重组蛋白的纯度。

1.8 小鼠抗CA16病毒血清的制备

将RD细胞接种到培养瓶中，当RD细胞长满80%时，加入CA16病毒悬液，37℃，5%的CO2培养箱中培养4～5 d，收集细胞并反复冻融三次，离心收集病毒悬液并腹腔注射5只BALB/c小鼠，病毒剂量按200 μL/只，共注射3次，每次间隔2周。第3次注射后1周采血，分离血清。

1.9 间接ELISA法检测重组蛋白的抗原性及有效性

将重组蛋白pET21b-CA16 VP1和pET32a用100 mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）以1：200稀释，分别包被于酶标板100 μL/孔，37℃孵育2 h，弃上清；10%的脱脂奶粉37℃封闭2h；每孔加入2倍系列稀释（1：20～1：5120）的小鼠抗CA16 病毒血清和太原市老年人血清100 μL，37℃孵育45 min，PBST洗液洗4次；加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的LD5 100 μL，37℃孵育45 min；PBST洗液洗4次，TMB显色液显色，于450 nm波长处测定吸光度值（A450）。

1.10统计学方法

实验数据使用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据符合偏态分布，两组间比较采用两独立样本的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义，采用GraphPad Prism 5软件进行作图分析。

2 结果

2.1 CA16 VP1 基因的扩增

以pET32a-CA16 VP1质粒为模板，P1、P2为上下游引物，PCR扩增CA16 VP1基因，CA16 VP1基因经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，可见891bp的特异性条带，大小与理论值相符，见图1。

2.2 pET21b-CA16 VP1质粒的鉴定

重组质粒pET21b-CA16 VP1经BamH I和Hind III双酶切，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，可见约5400 bp的载体片段和891 bp的目的基因片段，与理论值相符，见图2。

M：DL2000 Marker ；1：未酶切pET21b-CA16 VP1；

2：pET21b-CA16 VP1双酶切后产物

2.3 CA16 VP1蛋白的表达

将pET21b-CA16 VP1质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中诱导表达，经12% SDS-PAGE检测，结果可见相对分子质量约34KDa的条带，大小与理论值相符，重组蛋白pET21b-CA16 VP1主要存在于破菌沉淀中，以包涵体形式表达。经BandScan软件分析，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的24%，见图3。

2.4 CA16 VP1蛋白的纯化

重组蛋白CA16 VP1经Ni-NTA亲和层析纯化后，12% SDS-PAGE检测，结果可见相对分子质量约34KDa的单一蛋白条带，经BandScan软件分析，重组蛋白的纯度达90%以上。见图4。

2.5 CA16 VP1的抗原性分析

5只BALB/c小鼠经CA16病毒4次免疫后，用间接ELISA方法检测纯化的重组蛋白CA16 VP1与倍比稀释的小鼠抗CA16病毒血清的反应性，结果显示，小鼠抗CA16病毒血清可与纯化的重组蛋白特异性结合，A450值随小鼠抗CA16病毒血清浓度的稀释逐渐降低，以1∶20～1∶60稀释度下降尤为明显，与pET32a蛋白仅有较弱的结合，见图5。

2.6 CA16 VP1的有效性分析

95份太原市老年人血清与重组蛋白CA16 VP1的间接ELISA检测，结果显示：重组蛋白 CA16 VP1与太原市老年人血清反应的A450（中位数0.912，四分位数间距0.638）明显高于对照组pET32a蛋白与人血清反应的A450（中位数0.486，四分位数间距0.172），差异有统计学意义（P<0.01），见图6。将重组蛋白 CA16 VP1与太原老年人血清反应的A450值从高到低依次排列显示，A450值呈线性分布，出现高、中、低三种A450值，而且有7例血清的A450值明显高于其他人血清的A450值，见图7。

3 讨论

以往研究认为CA16仅引起轻微症状[13]，EV71能引起严重的并发症及死亡率[14，15]，因此大多数手足口病的研究主要针对EV71，CA16常被忽视。然而近几年研究发现，感染CA16的患者也能引起严重并发症[16]，甚至死亡[17]，CA16日益受到人们的重视。

本实验构建了重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了CA16 VP1蛋白，SDS-PAGE分析显示，表达的重组蛋白CA16 VP1主要以包涵体形式存在，之所以出现包涵体是因为这些蛋白在体内过量表达，以至于没有足够的时间正确折叠，二硫键不能正确地配对，过多的蛋白间非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度[18]，重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后纯度达90%以上，由于载体蛋白pET21b分子量很小，仅含有27个氨基酸，因此，选择pET32a载体蛋白作为阴性对照。

为确定重组蛋白CA16 VP1是否具有抗原性，我们用小鼠抗CA16病毒血清来检测重组蛋白CA16 VP1，结果表明，重组蛋白CA16 VP1与小鼠抗CA16病毒血清的反应明显高于与pET32a蛋白的反应，表明CA16 VP1蛋白具有良好的抗原性和特异性。本实验结果还显示，在每个血清稀释下，5只小鼠抗CA16病毒血清与重组蛋白CA16 VP1反应的A450值有高有低，而与pET32a蛋白反应的A450值均小于0.5且它们之间的差异很小，表明不同小鼠对相同CA16病毒产生的抗体不同，小鼠之间存在个体差异；小鼠抗CA16病毒血清与pET32a蛋白无结合反应。endprint

为进一步了解重组蛋白CA16 VP1能否有效检测人群中抗CA16 VP1抗体，我们用表达的重组蛋白CA16 VP1检测太原市老年人血清，结果表明，重组蛋白CA16 VP1作为抗原能有效检测人群中抗CA16 VP1抗体，有7例血清与重组蛋白存在高的结合反应，表明表达的重组蛋白能够成为一种临床检测用抗原。由于本次实验没有对这7例血清进行中和实验来确定他们是否感染过CA16病毒，有待我们在后续的实验中进一步验证。

综上所述，本实验成功构建了重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，原核表达并纯化了CA16 VP1重组蛋白，能与小鼠抗CA16病毒血清发生特异性反应，能检测出人血清中抗CA16抗体，说明其具有良好的抗原性和有效性，本实验为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。

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