ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备

李晓君　周文吉　周启武等

摘要：将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体pET32a（+）中，构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1，然后将其转入宿主菌BL21，经IPTG诱导后，宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白；将纯化后的融合蛋白免疫家兔，获得了ShSAP1的特异性抗血清；以融合蛋白作抗原，用间接ELISA法测定其抗血清效价为1 ∶25 000。

关键词：甘蔗；ShSAP1；锌指蛋白；原核表达；多克隆抗体

中图分类号： Q331 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0043-03

逆境相关蛋白（stress assiated protein，SAP）是植物中一类含有A20与AN1锌指结构的蛋白，该蛋白家族与植物的非生物胁迫应答密切相关。SAP基因的表达能够被1种或多种非生物胁迫诱导，转基因研究发现SAP家族基因可以增强转基因植物的对1种或多种胁迫的抗逆性[1]。目前关于SAP的作用机制还不是很清楚，研究发现SAP可能通过泛素蛋白酶途径、蛋白相互作用或作为氧化还原感受器参与植物的逆境应答过程[2-4]。ShSAP1（GenBank登录号HM991960.1）是由甘蔗（Saccharum officinarum L.）中克隆到的SAP家族基因，研究发现该基因的表达具有逆境应答特性[5]，目前正在开展ShSAP1的转基因功能分析。本研究构建了ShSAP1的原核表达载体，通过大肠杆菌原核表达系统进行ShSAP1的蛋白表达与纯化，并通过免疫家兔获得了抗血清，为ShSAP1蛋白功能研究及的后续的转基因检测打下了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原核表达载体pET32a（+）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕实验室惠赠，大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受态细胞感受态购自天根生化科技有限公司。rTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶，T4连接酶购自Fermantas公司，PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen公司，蛋白Marker、蛋白纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Goat Anti-Rabbit IgG-AP与BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。本试验所用的引物序列如下，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2 ShSAP1原核表达载体的构建

由甘蔗cDNA扩增ShSAP1基因阅读框，所用引物为PETZP1和PTEZP2，PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。纯化PCR产物，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对纯化后PCR产物和pET32a（+）质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物酶切片段和pET32a（+）大片段，用T4连接酶连接转化DH5α，重组质粒进行酶切验证后送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得原核表达载体pET-ShSAP1。

1.3 融合蛋白的小量表达

将pET32a（+）与测序验证后的原核表达载体pET-ShSAP1转化BL21（DE3），挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养。培养至D=0.6～0.8，各取1 mL分装于灭菌的1.5 mL EP管中，加等体积35%甘油，混匀，-70 ℃保存。试管中剩余菌液用加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导，37 ℃、200 r/min培养 3～4 h。超声波破碎菌体，取1.5 mL的EP管，分别取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min离心1 min。沉淀用100 μL的无菌水吹散。分别取10 μL上清和10 μL沉淀悬浮液进行 SDS-PAGE 分析，考马斯亮蓝R-250染色30 min后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式及表达量。

1.4 融合蛋白的大量表达与纯化

将小量表达验证过的pET32a（+）和pET-ShSAP1菌液进行划线培养，挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，于37 ℃活化培养8 h后，以1 ∶100稀释到400 mL含有Amp的LB液体培养基中，振荡培养至D600 nm值达到0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续于 37 ℃ 培养8 h诱导蛋白表达。8 000 r/min离心10 min，收集菌体，弃上清，加入30 mL Binding Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）重悬，使用超声波破碎法在冰浴中对菌体进行破碎，8 000 r/min离心10 min，分离裂解液上清保存，取10 μL上清液进行SDS-PAGE分析。

蛋白纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次后，以 6 mL Binding Buffer平衡亲和柱。取6 mL裂解液上清上柱，用6 mL Wash Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱杂蛋白，再分别以由低至高的咪唑浓度的6 mL Elute Buffer（500 mmol/L NaCl，50、100、200、500 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱融合蛋白，取10 μL洗脱液进行SDS-PAGE分析。同时，将纯化蛋白送往北京华大基因测序中心进行质谱测序分析。选取浓度与纯度较好的洗脱液进行1×PBS透析，透析3次后进行蛋白浓度测定既可用于免疫兔子，蛋白浓度（mg/mL）=1.45D280 nm-0.74D260 nm[6]。