引起猪腹泻的病毒分离鉴定

林庆燕，陈书琨，孙 洁，唐金明，2，陈 兵，卢体康，刘建利，廖立珊，曾少灵，祁振强，阮周曦，吕建强，杨俊兴，曹琛福，张彩虹，花群义，秦智锋＊

（1.深圳出入境检验检疫局，广东深圳518045；2.华南农业大学，广东广州510642；3.深圳市宝舜泰生物医药股份有限公司，广东深圳518001）

猪腹泻是现代规模集约化养猪场的一种常见的多因素性疾病。在猪的疾病中，出现腹泻症状的占35%～40%左右，尤其是仔猪，发病率更高，给养猪业造成重大经济损失［1-2］。猪腹泻性疾病致病因素复杂，猪只发病症状极为相似，临床上很难诊断。引起猪腹泻性疾病的病原体主要包括病毒，如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒A、猪圆环病毒、高致病性蓝耳病病毒；细菌，如致病性大肠埃希菌、巴氏杆菌、沙门菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、葡萄球菌；寄生虫，如附红细胞体、弓形体、螺旋体等；其他因素，如饲料发霉变质引起霉菌毒素中毒等。自从2010年12月以来，我国华东、华南、华北等部分地区出现以仔猪腹泻为主要特征的疾病，导致仔猪死亡增加，给养殖户造成了巨大的经济损失，对生猪养殖构成了很大的危害。2013 年，猪流行性腹泻病毒已蔓延美国13个州，造成了严重的经济损失［1-3］。

为了对猪的主要病毒性腹泻病进行研究，我们自2011年开始，连续3年对华南等地引起猪腹泻的主要病毒进行了分离鉴定，并进行了流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料和细胞系 从华南、江苏等地9个猪场采集发生腹泻、濒临死亡仔猪的小肠及内容物、粪便、哺乳母猪的乳汁等临床样品共38 份。Vero-76传代细胞系、猴肾传代细胞系（MA-104），由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心动检实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 DMEM 营养液，Gibco公司产品；胰蛋白酶（Trypsin），Invitrogen公司产品；猪胰酶（porcine pancreatin），Sigma公司产品；鸡IgY 纯化试剂盒，Thermo 公司产品；TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，Life tec公司产品；Qiagen Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司产品；ABI 7500HT荧光定量PCR仪，Qiagen EZ1advanced全自动核酸抽提工作站。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理

1.2.1.1 样品的采集 2011年，从华南地区3 个猪场采集具有腹泻临床症状的仔猪小肠内容物、粪便、哺乳母猪的乳汁样品12份；2012年从江苏2个猪场采集粪便临床样品11份；2013年从深圳、广州等4个猪场采集发生腹泻、濒临死亡仔猪的小肠及内容物、粪便，哺乳母猪的乳汁等临床样品15份。

1.2.1.2 样品的处理 取小肠内容物、乳汁和粪便样品，用生理盐水制成1∶10 的悬浮液，于4 ℃4 000r／min离心20 min，小心移去上层乳脂，取上清液经0.22μm 微孔滤膜过滤，收集滤液至少10 mL，分装编号，置-80 ℃保存。

1.2.2 样品的检测与鉴定 将各编号的38份滤液于Qiagen EZ1advanced全自动核酸抽提工作站抽提核酸后，按照TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒说明书于ABI 7500HT 荧光定量PCR 仪进行检测，分析检测结果。

1.2.3 PEDV 分离与传代 按常规方法复苏Vero-76细胞和MA-104传代细胞系，将细胞培养至单层时，每种细胞系分别接种编号为2011-PEDV-1、2012-PEDV-1和2013-PEDV-6的病毒滤液各1份，每瓶接种病料滤液1mL。接种病料滤液后的细胞37 ℃吸附1h，其间轻摇2次。吸附结束后，在Vero-76细胞培养瓶中，加入含有20μg／mL 胰酶、10 μg／mL猪胰酶和20 mL／L 胎牛血清的DMEM 维持液，37 ℃培养72h，作为一个传代周期。传代前，将上一次的细胞培养物反复冻融3次，按上述方法进行盲传，显微镜观察细胞病变，同时用TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒检测。传至第3代后，以后传代时只加入含有10μg／mL 胰酶和20mL／L 胎牛血清的DMEM维持液，37 ℃培养72h，作为一个传代周期。

1.2.4 PEDV 卵黄抗体的制备与纯化 将2013-PEDV-6的第3 代细胞培养液经超速离心后，按照常规方法采用5点法免疫注射蛋鸡3次，收集高免蛋黄液。将高免蛋黄液采用水稀释法和硫酸铵沉淀法进行粗提，再使用“鸡IgY 纯化试剂盒”进行纯化，得到高纯度的IgY 抗体。

1.2.5 PRoVA 的分离纯化 将1.2.4中制备和纯化获得的抗PEDV 高免卵黄抗体，与2011年混合感染的PEDV 和PRoVA 的样品编号为2011-PEDV＋PRoVA-1的MA-104细胞培养液，按照1∶1的比例混合。放置于37 ℃中和30 min。再于MA-104细胞系上进行传代。显微镜观察细胞病变，同时用TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒检测。再将传代培养液继续与PEDV 高免卵黄抗体反复中和、传代和检测，直至TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RTPCR检测试剂盒检测时PEDV 检测结果为阴性。

2 结果

2.1 多重实时荧光定量RT-PCR检测结果

3年从9 个猪场38 份临床样品采用TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒进行多重检测。2011年12份样品共检测到PEDV 和PRoVA 混合感染阳性样品2 份（编号：2011-PEDV＋PRoVA-1 和2011-PEDV＋PRoVA-2），只有PEDV 感染阳性样品4份。选取PEDV 和PRoVA 的Ct 值均最低的编号为2011-PEDV＋PRoVA-1的小肠内容物样品作为研究对象，荧光定量RT-PCR 扩增图见图1。2012年11份样品共检测到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染阳性样品6份，只有PEDV 感染阳性样品3份。选取母猪乳汁样品中Ct值均最低的编号为2012-PEDV＋PRoVA＋TGEV-3 的临床样品作为研究对象，荧光定量RT-PCR 扩增图见图2。2013 年15 份样品仅检测到PEDV 感染，且PEDV 均为阳性，无混合感染其他2种病毒。选取仔猪小肠内容物样品中Ct值最低编号为2013-PEDV-6的临床样品作为研究对象（荧光定量PCR 扩增图略）。对9个猪场的3年猪腹泻病毒性疾病流行病学调查表明，2011年—2013年主要是以PEDV 流行为主，各年份腹泻病毒统计见图3。

图1 2011年2份样品检测为PEDV 和PRoVA混合感染的样品检测结果Fig.1 Two samples were positive for PEDV＆PRoVA in 2011

2.2 PEDV的细胞分离与传代结果

样品在Vero-76 传代细胞系连传，通过在前3代传代细胞培养液中加入胰蛋白酶和猪胰酶，后续传代中只加入胰蛋白酶的方式，成功实现了PEDV在Vero-76细胞上的连续传代，且在第8 代出现了细胞病变（CPE）（图4）。各代细胞培养上清液进行TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RTPCR检测，均可检测出PEDV，且Ct值随着传代次数的增加而减少，表明病毒滴度随着传代次数的增加而增加。

图2 2012年编号为2012-PEDV＋PRoVA＋TGEV-3母猪乳汁样品检测为PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染Fig.2 Sow milk sample（2012-PEDV＋PRoVA＋TGEV-3）was positive for PEDV，TGEV＆PRoVA in 2012

2.3 PRoVA 分离与纯化结果

2011-PEDV＋PRoVA-1 接种MA-104 细胞系后，第1代即出现细胞病变（图5）。经TGEV／PED V／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测，结果PEDV 和PRoVA 均为阳性。通过用2013-PEDV-6制备的高免血清，连续中和3 代，于MA-104混合感染的2011-PEDV＋PRoVA-1细胞培养液，在第4代再次进行TGEV／PEDV／Rotavirus三重实时荧光定量RT-PCR检测，结果只有PRoVA为阳性，PEDV 检测结果为阴性，表明成功分离纯化出PRoVA，编号为2011-PRoVA-1。

图3 2011年—2013年猪3种腹泻性病毒检测统计结果Fig.3 Statistical results of PEDV，TGEV＆PRoVA among 2011-2013

图4 Vero-76正常传代细胞、接种PEDV 后第1代和出现CPE后的第8代细胞培养结果Fig.4 CPE of 8th passage and 1st of passage with PEDV and normal Vero-76cell line

图5 MA-104正常传代细胞、接种2011-PEDV＋PRoVA-1毒株后第1代出现CPE Fig.5 CPE of 1st of passage with 2011-PEDV＋PRoVA-1strain and normal MA-104cell line

3 讨论

3.1 猪腹泻性疾病流行病学分析

自2011年开始，猪腹泻性疾病在我国出现大规模流行，并有愈演愈烈的趋势。在2011年采集的12份样品中，检测到有PEDV 感染或者PEDV 与PRoVA 混合感染的共有6份，其他样品检测结果3种病毒均为阴性。但不能排除剩余的6份样品中有其他病毒、细菌或者寄生虫。美国对2013年猪场猪腹泻性疾病的普查结果显示，猪场中有轮状病毒C感染存在［4-5］。也有研究认为，从患有腹泻性疾病的猪的临床样品中分离到产肠毒素大肠埃希菌K88、K99、987P等，也有检测到猪博卡病毒的［6-7］。在2012年11 份样品中，共检测到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染阳性样品6份。可能在2011年出现猪腹泻疫情后，各养殖猪场加大了猪腹泻性疾病的防控，添加或使用抗菌药物预防细菌性和寄生虫性腹泻，使用一些腹泻病毒的疫苗，尤其是PEDV 活苗、TGEV活苗和PRoVA活苗来加大病毒性腹泻疫病的控制，但效果不佳。在我们检测到的3 种病毒中，TGEV和PRoVA可能来自疫苗毒，需要进一步测序确定。PEDV 分离株的S蛋白基因测序初步表明，与传统的PEDV毒株差异较大，估计是发生了较大的变异所致。2013年，15份样品中全部只分离到PEDV，并没有分离到其他病毒，估计是猪场发现使用疫苗效果不理想后，暂时停止使用活苗进行免疫，所以只分离到了PEDV。这3 年引起猪腹泻性疾病的主要病原体应该是PEDV 的变异株，而检测到的TGEV 和PRoVA，可能是疫苗株，并不引发猪腹泻。值得注意的是，在2012年和2013年，均采集了哺乳母猪的奶汁进行3种腹泻性病毒的检测，在母猪奶汁中发现大量的PEDV 存在，荧光定量RTPCR 的Ct值有时小于小猪小肠内容物的Ct值，表明母猪奶汁中PEDV 的含量高于发病仔猪小肠中病毒含量。这与猪场反映刚出生的仔猪吃完母猪奶汁后即出现腹泻的现象一致。尽管母猪不发病，建议有腹泻病例的猪场，暂时停止喂饲刚出生的仔猪。流行病学调查表明，这次多个地区发生和流行仔猪腹泻性疾病，主要病原是猪流行性腹泻病毒。其次是传染性胃肠炎病毒，也有猪轮状病毒病、Kobu病毒等，部分养殖场还有致病性大肠埃希菌和沙门菌继发感染［8-9］。

3.2 PEDV 和PRoVA 的分离培养

PEDV 和PRoVA 均可在MA-104细胞系、PK-15细胞系上生长，但需要经过胰酶处理［10］。本研究由于没有单独分离到PRoVA，所以采用中和方法中和PEDV，成功分离纯化到PRoVA。PRoVA 接种约48h后出现细胞病变（CPE），细胞肿胀变圆、折光性增强，颗粒物质增多；随着培养时间的延长，细胞固缩、隆起、脱落，细胞间隙变大，到72h时细胞大量脱落（70%以上），瓶壁上的细胞拉成网状。

由于PEDV 具有细胞毒性，很难在细胞上进行连续传代［4］。本研究分离PEDV 时，采用了Vero-76细胞系，刚开始只加入了胰蛋白酶，连续盲传3代，显微镜下观察每代细胞培养状况，发现PEDV 接种细胞后，第1、2、3代均不出现细胞病变。但在第4代传代培养后，发现出现病毒丢失现象，实时荧光定量RT-PCR检测结果为阴性。后来采取在第1代～3代添加大量胰蛋白酶，同时再添加了一定浓度的猪胰酶，成功实现了PEDV 在Vero细胞上的连续传代。但在4代～8代的每次传代后，细胞培养液中病毒的滴度开始下降，实时荧光定量RT-PCR 的Ct值增加。在传至第8代后出现了细胞病变（cell pathogenic effect，CPE），细胞培养上清液中PEDV 的实时荧光定量RT-PCR检测时Ct值逐步降低，表明自第8代出现CPE病变后，细胞培养液中的病毒滴度在不断增加。

为了分离纯化猪轮状病毒A，用2013年分离到的PEDV 毒株制备卵黄抗体，纯化抗体后中和2011年混合感染PEDV 和PRoVA 的MA-104细胞培养液，再于MA-104细胞系上进行传代。通过不断地中和传代，经多重实时荧光定量RT-PCR检测，在第5代MA-104细胞培养液中只检测到PRoVA，没有检测到PEDV，表明纯化得到PRoVA。

通过本项目的研究，分离获得了猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A，并成功实现了细胞传代，为疫苗的研发奠定了基础。

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