布鲁菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达

关 团，张 辉，王 震，孙志华，刘 娟，韩玉霞，王文华，江雅丽，陈创夫

（石河子大学动物科技学院，新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子832003）

布鲁菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁菌（Brucella）引起的全世界范围内的人兽共患传染病［1］。布鲁菌是一种无芽胞革兰阴性球杆菌，在微需氧环境下即可生存，是一种部分耐酸性细菌，没有天然的质体，无荚膜，会导致天然宿主持续感染的网状系统疾病。该病主要特点是出现“波状热”，关节炎，心内膜炎以及人脑膜炎和动物的流产，如果治疗不及时会发展为慢性感染［2］。目前接种疫苗是预防布鲁菌传播的最有效途径，然而布鲁菌的保护性抗原分子并不明确，细胞、体液免疫应答低，相关研究至今仍无突破性进展。近年来，具有抗原保护作用的布鲁菌诊断抗原成为该菌的研究热点，因此布鲁菌外膜蛋白备受关注，其中 Ompl0、Omp19、Omp25、Omp31和bp26均为强免疫原性蛋白，并具有保守的DNA 序列［3］。在某些疫苗株中弱化或缺失bp26基因，对于鉴别自然感染和疫苗免疫具有重要的现实意义［4］。

二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLDH）又称二氢硫辛酸脱氢酶或硫辛酰胺脱氢酶，属黄素蛋白氧化还原家族［5］，是组成3种α丙酮酸脱氢酶复合体的必需组成成分［6］。其主要分布在动物、植物或微生物的线粒体中，细胞质膜上也部分存在该酶［7］。研究表明，二氢硫辛酰胺脱氢酶参与生物体的新陈代谢，并在代谢途径中发挥重要功能，而且，二氢硫辛酰胺脱氢酶的生物学功能在不断被发现［8-9］。据报道，在大肠埃希菌中，二氢硫辛酰胺脱氢酶参与了甘氨酸的降解，是降解体系的重要组成部分，具有依赖蛋白质和辅酶Q 转运乳糖和麦芽糖的作用［10］。在Neisseria meningitidis中，二氢硫辛酰胺脱氢酶是免疫性表面抗原。张静等［11］研究表明二氢硫辛酰胺脱氢酶可能与猪链球菌的黏附相关，已有大量研究报道表明在其他细菌中该酶作用在胞内或质膜上。关于布鲁菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的研究，仅见布鲁菌BMEI 0145基因编码二氢硫辛酰胺脱氢酶。本研究通过PCR 方法扩增并表达羊种布鲁氏菌043 株BMEI0145，为进一步揭示二氢硫辛酰胺脱氢酶在布鲁菌侵染宿主过程中的致病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠埃希菌（E.coli）DH5α和BL21（DE3）感受态细胞，天根生化科技有限公司产品；羊种布鲁菌043分离株、pET-28a（＋）载体，由石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ，TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker、蛋白Marker、pMD18-T 载体，宝生物工程（大连）有限公司产品；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，天根生化科技有限公司产品；辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG-HRP、蛋白Marker，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；IPTG，Merck 公司产品；布鲁菌胰酶蛋白大豆培养基（TSA、TSB），BD 公司产品；布鲁菌阳性血清，本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank登录的布鲁菌（NC-003317）BMEI 0145基因序列和载体pMD18-T、pET-28a 的多克隆位点（multiple cloning site，MCS），应用Primer premier 5.0软件设计引物P1／P2，扩增BMEI 0145 基因完整的ORF 阅读框序列，下划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点（表1），引物的合成及序列的测定由北京华大基因公司完成。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primers and sequences

1.2.2 目的基因的克隆与纯化 以100 ℃热灭活45min的羊种布鲁菌043分离株为模板，PCR 方法扩增BMEI0145基因片段。采用20μL PCR反应体系：2×TaqMaster Mix（内含TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2及反应缓冲液和蓝色染料）10 μL，上游引物P1（25μmol／L）0.2μL，下游引物P2（25μmol／L）0.2μL，模板2μL，补水至20μL；PCR反应条件：95℃5min；94 ℃40s，63℃40s，72℃2 min 10s，30个循环；最后72℃7min。PCR产物进行10g／L琼脂糖凝胶电泳分析，使用琼脂糖凝胶DNA 回收纯化试剂盒纯化回收目的基因，按产品说明书进行操作。

1.2.3 重组质粒pMD18-T-BMEI 0145的构建与测序 将纯化的PCR 产物与pMD18-T 载体在16 ℃条件下连接过夜，转化E.coliDH 5α感受态细胞，均匀涂布于氨苄青霉素抗性的LB 固体培养基平板上，37 ℃培养16h，挑取生长良好的单克隆菌落，菌液PCR 筛选阳性克隆，提取质粒并进行BamHⅠ／XhoⅠ双酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒送华大基因公司进行测序，测序正确的质粒命名为pMD18-T-BMEI 0145。

1.2.4 重组表达载体pET-28a-BMEI 0145的构建与鉴定 使用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pMD18-T-BMEI 0145和表达载体pET-28a，37 ℃酶切4h；经10g／L 琼脂糖凝胶电泳检测后回收BMEI 0145基因片段和pET-28a酶切产物。将回收的BMEI 0145目的基因与表达载体pET-28a于16 ℃过夜连接。将连接产物转化入大肠埃希菌DH 5α感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性的LB 培养基平板上，37℃培养12h～18h，挑取生长良好的单菌落进行阳性筛选，对筛选的菌落进行PCR 和双酶切筛选鉴定阳性克隆，对鉴定正确的重组质粒送华大公司进行测序，测序正确的重组表达质粒命名为pET-28a-BMEI 0145。将pET-28a-BMEI 0145质粒转化E.coliBL 21（DE3）感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上，37 ℃培养12 h～18h，挑取生长良好的单菌落，筛选阳性克隆。

1.2.5 重组蛋白His-BMEI 0145的诱导表达 将阳性克隆接种到含有卡那霉素抗性（100 mg／L）的LB 液体培养基 中，37 ℃、200r／min摇菌过夜。吸取200μL菌液接种到20mL 含卡那抗性的LB 液体培养基中，37℃、180r／min培养至OD 600nm 为0.4～0.6，加入终浓度为1.0mmol／L的IPTG 诱导表达，分别于0、2、4、6、8h取样。同时设空载体和未加IPTG 诱导的重组菌作为对照。

1.2.6 重组蛋白His-BMEI 0145的Western blot分析 将收集的菌液，12 000r／min离心2min后弃上清，加入80μL去离子水和20μL 5×上样缓冲液悬浮菌体，煮沸10 min，进行120g／L SDS-APGE电泳。使用考马斯亮蓝染色鉴定BMEI 0145蛋白的表达。使用半干式电转印仪，将SDS-PAGE 凝胶上的蛋白样品转印到0.45μm NC 膜上（200 mA，60min）；用Western blot膜封闭液封闭1h；TBST洗涤3次，每次10min；加入1∶500稀释的布鲁菌阳性血清，37 ℃孵育1h；TBST 洗涤3次，每次10 min；加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗羊IgG，孵育1h；TBST 洗涤3次，每次10 min；加入DAB底物显色液进行显色反应；显色完成后使用水终止。

2 结果

2.1 BMEI 0145基因的扩增、克隆及酶切鉴定

用P1／P2引物扩增BMEI0145基因，PCR 扩增产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测得到约1404bp的目的条带，与预期结果相符（图1）。将其克隆到pMD18-T 载体中，转化E.coliDH 5α，提取克隆质粒，用限制性内切酶BamHⅠ／XhoⅠ双酶切鉴定（图2），并对阳性质粒进行测序分析，表明本试验获得的BMEI 0145基因片段的长度及序列与布鲁菌BMEI 0145基因一致。

图1 BMEI 0145基因PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplication results of BMEI 0145gene

图2 pMD18-T-BMEI 0145双酶切鉴定Fig.2 The enzyme digestion identification of recombinant plasmid PMD18-T-BMEI 0145

2.2 pET-28a-BMEI 0145原核重组表达载体构建及鉴定

BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET-28a 质粒和pMD18-T-BMEI 0145质粒，并回收pET-28a载 体片段和BMEI 0145基因片段，将回收片段连接，连接产物转化至E.coliDH 5α感受态细胞。筛选阳性重组菌，提取质粒；重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到1 404bp 的目的条带和5369bp的pET-28a 载体片段（图3）。结果表明pET-28a-BMEI 0145原核表达载体构建成功。

2.3 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

将鉴定正确的pET-28a-BMEI 0145重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性重组菌，后经IPTG 诱导表达，SDS-PAGE分析结果表明，重组BMEI 0145蛋白分子质量约为62ku（图4），与理论值相符合，目的蛋白在4h时的表达量最高。

图3 pET-28a-BMEI 0145双酶切鉴定Fig.3 The enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-28a-BMEI 0145

图4 重组蛋BMEI 0145的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein BMEI 0145

2.4 BMEI 0145基因表达产物Western blot分析

将重组蛋白转至NC 膜，采用布鲁菌阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗羊抗体为二抗进行免疫印迹分析。Western blot结果表明诱导后在62ku的位置上有一条特异的反应条带，与理论分析值相符合（图5）；表明重组蛋白与抗布鲁菌抗体发生特异性反应；说明重组的BMEI 0145蛋白与相应天然蛋白具有相同的抗原性。

3 讨论

布鲁菌是兼性胞内寄生菌，可引发全球范围内人和牲畜及野生哺乳动物的感染，引起人兽共患慢性传染病，也是当前生物武器研究的热点［12］。布鲁菌引发的传染性疾病和巨大的经济损失已经引起全世界的关注。人一旦得了该病，目前尚无彻底根治的方法。目前预防和控制布鲁菌病的主要手段仍然是接种减毒活疫苗，然而减毒活疫苗可能存在毒力回复、隐性感染以及返祖现象等危险［13］。因此，研发新型的更安全的布鲁菌疫苗已经是当前学者共同追求的方向。细菌黏附和入侵在细菌与宿主细胞相互作用中是一个非常复杂的过程，而且是介导细菌感染的首要条件。与其他细胞内寄生细菌一样，布鲁菌感染宿主细胞需经过黏附、侵入、运输、复制、传播等多个步骤。因此，研究布鲁菌的黏附和入侵对揭示布鲁菌致病机制有一定的帮助。

图5 重组蛋白pET-28a-BMEI 0145的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of recombinant proteinpET-28a-BMEI 0145

二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLDH）是黄素蛋白氧化还原家族的一种，是组成3种α丙酮酸脱氢酶复合体的必需组成部分。其大部分存在于大多数生物的线粒体中，少部分存在于质膜上。由于二氢硫辛酰胺脱氢酶在生物体代谢途径中的重要作用，目前关于二氢硫辛酰胺脱氢酶的生物学功能不断有新的发现。据报道，大肠埃希菌二氢硫辛酰胺脱氢酶是甘氨酸降解体系的组成部分，具有依赖蛋白质和辅酶Q 转运乳糖和麦芽糖的作用，该酶在脑膜炎奈瑟菌中是免疫性表面抗原，张静等研究表明二氢硫辛酰胺脱氢酶可能与猪链球菌的黏附相关。该酶均作用在胞内或质膜上，该酶分泌至胞外显然有其特殊的生理功能。二氢硫辛酰胺脱氢酶广泛存在于动物器官、植物组织、原生动物及多种微生物中［14］，在代谢途径中发挥着重要的作用，对细菌的致病性存在重要的意义，但在人兽共患病原微生物尤其是布鲁菌尚未报道。

由于二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌中为膜蛋白，而多种细菌的膜蛋白已被证明参与细菌黏附宿主细胞的过程，如脑膜炎球菌以及某些致病性大肠埃希菌的黏附作用就是由外膜蛋白决定的［15-16］。同样布鲁菌Omp10等外膜蛋白已在相关的研究中进行了报道。本研究发现融合蛋白能够被布鲁菌感染阳性血清特异性识别，而载体蛋白与阳性血清并不能产生反应，证明该蛋白具有良好的抗原性。当然二氢硫辛酰胺脱氢酶在布鲁菌致病机理中的具体功能，还需进一步的研。

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