猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及鉴定

郭东光，朱艳平，孙国鹏，岳 峰，贾文科，王 军，2，李 鹏，2，王自浩，王选年＊

（1.新乡学院生命科学与技术系生物技术研究中心，河南新乡453003；2.郑州大学，河南郑州450000）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是严重危害我国养猪业的主要传染病之一，是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种急性、发热性、高度接触性传染病［1］。CSFV 基因组为12.3kb的单股正链线性RNA，包含一个开放性阅读框（ORF），编码一个由3 898个氨基酸组成的多聚蛋白。此多聚蛋白经病毒和宿主细胞酶的作用形成4个结构蛋白（C、E0、E1、E2）和8个非结构蛋白（p7、Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）［2］。E0、El和E2是CSFV 病毒粒子3 种囊膜糖蛋白，其中E0 和E2 是病毒诱导机体产生中和抗体的2个主要保护性抗原，同时也是病毒吸附、穿入敏感细胞的必需糖蛋白［3］。E0 蛋白由232 个氨基酸残基构成，分子质量约为44ku～50ku，其同源二聚体分子质量为97ku，无疏水的膜锚定结构，能直接从被感染的细胞内分泌到细胞外，为可分泌性蛋白，并可诱导机体产生中和抗体抵抗致死剂量CSFV 的攻击［4］。在CSFV 中编码E0的核酸序列比编码E2的序列相对保守，因此，表达E0 蛋白也可作为CSF 亚单位疫苗的潜在抗原［5］。中和试验表明，E0 与CSFV 的宿主嗜性有关，用针对E0的单克隆抗体可有效阻断CSFV 对易感动物细胞的感染［6］。易感动物感染CSFV 后可产生针对E0、E2和NS2-3的抗体，但针对NS2-3的抗体不能用于疫苗毒和野毒鉴别诊断，只能用E0蛋白的抗体进行鉴别诊断，特别是当疫苗中用E2作为主要免疫原时，就需要标记E0蛋白来进行血清学鉴别是否存在潜在感染［7］。本研究以CSFV E0基因为研究对象，利用大肠埃希菌原核表达系统成功表达并获得了E0重组目的蛋白，通过Western blot验证该蛋白具有良好的反应原性，能用于临床CSF 抗体的检测，为研究CSFV 抗体检测试剂盒奠定了抗原基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体及工具酶 大肠埃希菌（E.coli）DH5α工程菌、Rostta（DE3）工程菌、质粒pGEX-CSFV全长质粒由河南科技学院动科学院胡建和教授惠赠；原核表达载体pGEX-4T-2由本实验室保存；ExTaqDNA 聚合酶、核酸内切酶BamH I、XhoⅠ，pMD18-T-simple vector systems、T4DNA 连接酶均为TaKaRa公司产品；普通TaqDNA 聚合酶，为北京鼎国公司产品。

1.1.2 主要试剂 质粒小量提取试剂盒，TIANGEN公司产品；琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒，OMEGA公司产品；CSFV兔化高免血清由本实验室制备；HRP标记的羊抗兔二抗、AEC显色试剂盒均为北京中杉金桥生物公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计及合成 根据已发表在GenBank CSFV C株序列AF531433.1，设计一对特异性引物用于扩增CSFV E0基因片段，并在其上、下游两端加上BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点，扩增目的片段长度为561bp。该引物由北京鼎国生物技术有限公司合成，其引物设计如下：F：5′-CGGGATCCGCCACAGACGTGGAGCTGAAAG-3′；R：5′-CCCTCGAGTTAACAGTAAGGCGATAGGGCATAAGC -3′。

1.2.2 CSFV E0目的基因的扩增 以pGEX-CSFV全长质粒为模板，ExTaqDNA 聚合酶进行目的基因片段的扩增，取扩增产物于10g／L琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.3 重组表达载体的构建及菌液PCR和双酶切鉴定 将纯化后的PCR 产物连接至pMD18-T-simple vector，经鉴定正确后，命名为pMD18-T-simple-E0。双酶切回收目的片段，于16℃水浴中过夜连接至表达载体pGEX-4T-2，经鉴定后命名为pGEX-4T-2-E0。取连接产物转化至E.coliDH5α工程菌后进行菌液PCR鉴定。其检测方法同1.2.2。将上述菌液PCR鉴定的阳性重组子，进行双酶切鉴定。取适量酶切产物在10g／L琼脂糖凝胶中检测结果。

1.2.4 pGEX-4T-2-E0的诱导表达和优化 将测序正确的重组质粒pGEX-4T-2-E0，转化至大肠埃希菌Rostta（DE3），加入IPTG 至终浓度为1.0 mmol／L，分别于37℃、28℃、18℃诱导4h，SDSPAGE检测最佳诱导温度。在确定的最佳诱导温度下按上述方法重新诱导培养4h，分别加入IPTG 浓度为1.0、0.8、0.6、0.2mmol／L，诱导结束后SDSPAGE检测最佳IPTG 浓度。

1.2.5 可溶性分析鉴定 最佳诱导条件进行诱导表达，收集菌体后超声波裂解破碎菌体，分别收集沉淀和上清进行SDS-PAGE检测，确定目的蛋白的表达形式。

1.2.6 表达产物的Western blot鉴定 用半干转转膜仪在电压为25V 条件下转膜45 min。结束后取出PVDF 膜，TBST 洗膜3次，用50g／L 脱脂奶粉4℃封闭过夜；再用TBST 洗膜3次，分别按1∶200和1∶2 000 的比例加入猪瘟兔化高免血清和GST 单抗稀释液于室温反应2h；TBST 洗膜3次，分别按1∶2 000的比例加入HRP羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗于室温反应1h；TBST 洗膜3次，AEC 显色试剂盒显色，ddH2O 冲洗终止显色后观察。

1.2.7 目的蛋白的纯化 取适量已裂解包涵体于PE管内，加100μL 2×SDS Loading buffer，再加入等量的包涵体裂解溶液，混合均匀后按常规方法进行电泳，每块胶的上样量为200μL～500μL。电泳结束，取出胶块用0.1mol／L 的KCl染色10min～20min，待银白色的目的条带清晰出现后，切下目的条带，透析，进行水平电泳（120 V，220 mA）2h～4h。电泳结束后，将透析袋放在新鲜的PBS中，低温透析过夜。收集透析袋内的上清，适当离心后即为重组目的蛋白。

2 结果

2.1 目的片段的PCR 扩增结果

取适量PCR 产物于10g／L 的琼脂糖凝胶电泳检测，观察到一条与理论值大小相符的目的条带，约561bp（图1）。

图1 E0基因的PCR 扩增结果Fig.1 PCR results of E0gene

2.2 pGEX-4T-2-E0的菌液PCR 和双酶切鉴定结果

PCR 和双酶切鉴定所挑取菌落，均在561bp处出现了特异性目的条带（图2和图3）。其结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2-E0。

图2 重组表达质粒pGEX-4T-2-E0的菌液PCR鉴定Fig.2 Identification of recombinant expression plasmid pGEX-4T-2-E0by PCR

图3 重组表达质粒pGEX-4T-2-E0的双酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant expression plasmid pGEX-4T-2-E0by BamHⅠand XhoⅠdigestion

2.3 pGEX-4T-2-E0的诱导和优化结果

分别将37℃、28℃、18℃诱导的样品处理后，SDS-PAGE检测，结果发现pGEX-4T-2-E0在37℃表达（图4）。在此条件下不同的IPTG 浓度诱导4h，结果证明IPTG 浓度在1.0mmol／L 时其表达量相对较高（图5）。其结果表明重组表达菌株在37℃、IPTG 浓度在1.0mmol／L时为其最佳表达条件。

图4 重组表达质粒pGEX-4T-2-E0的不同温浓度诱导结果Fig.4 The induced expression levels of pGEX-4T-2-E0at different temperatures

图5 重组表达质粒pGEX-4T-2-E0在不同IPTG 浓度诱导结果Fig.5 The induced expression levels of pGEX-4T-2-E0at different concentrations

2.4 表达产物的Western blot鉴定结果

Western blot结果显示，重组蛋白均与猪瘟兔化高免血清和GST 标签单抗在46ku左右出现了特异性目的条带（图6），证明所表达的融合蛋白被正确表达且具有良好的抗原性。

图6 重组蛋白和猪瘟兔化高免血清和GST 标签单抗反应Fig.6 pGEX-4T-2-E0／Rostta（DE3）proteins reacted with CSFV positive serum and GST monoclonal Ab

2.5 表达产物的可溶性分析及目的蛋白的纯化

分别将处理的样品取上清和沉淀进行SDSPAGE检测，结果显示沉淀中含有大量目的蛋白（图7），说明目的蛋白以包涵体形式表达。包涵体经切胶纯化处理后，获得纯较高的目的蛋白（图7），其含量为1.0mg／mL。

图7 SDS-PAGE重组目的蛋白的纯化Fig.7 Analysis of purified recombinant E0proteins by SDS-PAGE

3 讨论

E0 是CSFV 重要结构糖蛋白，参与构成CSFV病毒粒子的外衣壳，介导CSFV 的早期感染，诱导机体产生中和抗体［8］。因此，E0蛋白在标记疫苗的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能，该蛋白对于监测CSFV 的流行情况、疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要的作用［9］。特别是处于抗原表位的191～227氨基酸，也能区分瘟病毒属中的CSFV、BVDV 和BDV，是目前诊断CSFV 抗体的理想抗原［10］。此外，E0 基因具有RNase活性，该活性能够影响宿主细胞中病毒RNA 的复制，并且对感染动物早期的免疫防御有一定的抑制作用［11］。研究显示，E0可降解自身的RNA ，但在猪瘟病毒感染过程中可通过一种特殊的保护机制使自身RNA 与E0的隔离，从而避免对自身的降解。RNase 除降解RNA 外，还具有细胞毒性、抗蠕虫和免疫抑制活性、抗肿瘤、免疫调节等作用［12］。本研究的前期研究表明，在E0蛋白上存在一段多肽序列，该段多肽能有效结合靶细胞，与CSFV 共同竞争被感染细胞中存在的病毒受体，从而有效抑制CSFV 的入侵。本研究为进一步验证该多肽序列在E0蛋白上的功能和作用，顺利得到所需重组目的蛋白，采用了多个原核表达系统进行尝试，针对目的片段我们分别选择了pET-30a（＋）、pET32（a）＋和pGEX-4T-2，诱导发现E0 蛋白只在原核表载体pGEX-4T-2 中得到表达，并且只有在37℃明显表达。其原因可能与原核表达系统无修饰功能有关，也可能与其N 端部分的疏水碱基序列的影响，不利于蛋白质的起始翻译有关，需要融合标签的引导才能起始E0 蛋白的翻译［13］。国内学者李鹏、陈振海、吴素丽等也表达了该蛋白，但效果均不佳，主要是存在表达量低，不容易纯化等问题［14-16］。本研究为克服以上研究的缺点，分别在表达载体上和表达宿主菌上进行了筛选，最终确定了最佳表达载体为pGEX-4T-2，最佳诱导宿主菌为Rosetta细胞。另外，为克服因表达形式为包涵体不容易纯化的特点，本研究采用切胶回收的纯化方法，其操作简单、方便，并且获得了纯度较高的重组目的蛋白，为后续多肽功能研究和抗体检测打下了很好的抗原基础。

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