乌鳢致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究

康元环，孟庆峰，夏京津，龙继兵，盛宇轩，陈 龙，单晓枫＊，钱爱东＊

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062）

乌鳢（Channa argus）俗称才鱼、墨鱼、乌鱼，是一种经济价值与营养医学价值均较高的淡水名贵鱼类。其味美肉鲜，蛋白含量较高，且具有去瘀生新、健脾利水等医疗功效，受到了广大消费者的推捧。目前，乌鳢已成为特种养殖品种一族，其养殖规模也在逐年扩大。但由于养殖的集约化，在养殖过程中有一部分养殖户缺乏对传染病有效控制的理念，致使乌鳢各种细菌性病害逐渐严重，制约了乌鳢养殖业健康而且可持续发展［1］。2010 年6～8 月间，吉林省某乌鳢养殖场养殖的乌鳢出现大量死亡，病鱼主要表现为体表有大量出血点，鳍条充血，肛门红肿，剖检可见主要组织脏器有出血点，肠道充血。从病死鱼体内分离到一株致病性病原菌，经理化特性、16SrRNA 序列分析，对该菌进行了鉴定；同时对该菌的耐药性进行了分析，并对其携带的部分毒力基因进行了验证，为该菌引发的疾病的防治提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 病鱼采自吉林省某乌鳢养殖场患病鱼；健康乌鳢由吉林省某养殖场提供，体重150 g左右。

1.1.2 主要试剂 RS琼脂、营养琼脂、营养肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司；DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶购自TaKaRa公司；细菌微量生化反应管、药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 致病菌的分离 取患病的乌鳢，无菌操作，取肌肉、心血等组织，划线接种于RS琼脂平板级营养琼脂平板上，28℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯培养，4℃保存备用。

1.2.2 致病菌的人工感染试验 将菌株接种于营养肉汤中，28℃震荡培养16h～18h，用平板计数法计算菌液浓度。用无菌生理盐水稀释至2.43×107cfu／mL的菌悬液，试验组腹腔注射接种健康乌鳢，每尾注射剂量0.3mL，对照组注射0.3mL 无菌生理盐水，每组各注射9尾，水温保持22℃左右。持续观察7d，记录试验乌鳢发病与死亡情况，同时对人工感染的病死鱼进行病原菌再分离，观察再次分离菌株在形态及理化特性是否与原分离菌株一致。

1.2.3 菌体形态观察及主要理化特性的测定 将纯化的病原菌28℃培养16h～18h后，革兰染色，观察菌体形态。另取纯培养物接种于生化反应管中，具体操作以微量生化反应管说明书为参照。

1.2.4 16 SrRNA 鉴定及基因序列分析 分子生物学操作以参考文献［2］为参照进行，引物为细菌通用引物（表1）。PCR 产物经10g／L 琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化，引物合成与测序由华大公司完成。菌株16SrRNA 基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列相似性比较，使用Mega4.0软件构建系统发育树并进行分析。

1.2.5 药敏试验 采用涂布法将一定浓度致病菌菌液接种于营养琼脂平板上，贴上药敏纸片，28℃培养24h，测量抑菌圈直径。

1.2.6 致病菌部分毒力基因的检测 依据已发表致病菌的几种毒力基因序列，并参照其他文献［3-4］，设计并合成引物。引物退火温度、扩增目的片段大小如表1所示。

2 结果

2.1 细菌分离及菌体形态

从病死鱼体内分离到一株优势菌株，暂命名WL161。该菌株为革兰阴性菌，28℃培养16h～18 h后，菌体呈多形性，长丝状与短杆状并存，散在，短杆状两端钝圆，无芽胞。该菌株营养琼脂上菌落呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，白色，不甚透明，在RS琼脂上菌落呈圆形、光滑湿润，菌落呈黄色。

2.2 人工感染试验

将菌株WL161腹腔接种于健康乌鳢，在7d内大部分死亡（7／9），全部发病，对照组无异常。将病死鱼剖检，病症及眼观病理变化与自然发病鱼相同，从中分离出与WL161形态和理化特性相同的细菌。

2.3 主要理化特性

菌株WL161的理化特性如表2所示。结合菌落与菌体特征，参照文献［5］，初步判定细菌WL161为维氏气单胞菌。

表1 PCR反应的引物序列和目的片段大小Table 1 The primer sequences and length of target fragments

表2 分离菌的理化特性Table 2 Physicochemical properties of the isolates

2.4 16SrRNA基因序列分析结果

以菌株WL161的基因组模板，通过16SrRNA通用引物，扩增出长度约1 500bp的片段（图1），将该基因序列用Blast软件进行相似性比较，与维氏气单胞菌16SrRNA基因序列相似性为99.5%，并构建系统发育树（图2），发现菌株WL161与A.veronii处于同一进化分支。

2.5 药敏试验

菌株WL161对单环菌素、利福平、呋喃妥因、氯霉素、阿奇霉素、头孢克肟、头孢曲松钠、氟哌酸、恩诺沙星、奥复星、复方新诺明等药物呈现高度敏感；对克林霉素、红霉素、丁胺卡那、新生霉素、环丙氟哌酸、多黏菌素B等药物中度敏感；对万古霉素、青霉素G、氨苄青霉素等药物耐药。

2.6 致病菌部分毒力基因的检测

经PCR检测，维氏气单胞菌WL161株携带多种毒力基因（图1）。

图1 16SrRNA 基因及其毒力基因Aha、LuxS、aer、ser、act扩增Fig.1 PCR detection results of Aha，LuxS，aer，ser，act and 16SrRNA genes

3 讨论

维氏气单胞菌是气单胞菌属的一个种，广泛存在于水环境、土壤及动物消化道中，该菌不同菌株的毒力有强弱之分，强毒株除感染人类并引发疾病外，还可感染多种水生动物且病例逐年增多，已逐渐成为水产养殖业危害较大的病原菌［6-10］。本研究从患病乌鳢体内分离出一株致病菌，经动物回归试验，证明其对乌鳢有较强的致病力。经菌落形态、理化特性及16SrRNA 测序，鉴定为维氏气单胞菌。该菌的菌体形态在人工培养18h 后，经革兰染色观察，发现其具有多形性——即短杆状与长丝状并存，这并未在其他发表文献中提及，但本实验室在几十株不同源性维氏气单胞菌菌体形态观察中发现，多形性是一种普遍现象，有别于其他气单胞菌，是否可以认为，菌体多形性是维氏气单胞菌特性，仍需更多菌株验证。

强毒力的维氏气单胞菌可以产生多种毒力因子，如气溶素、丝氨酸蛋白酶、肠毒素等。经PCR检测，菌株WL161携带多种毒力基因，其动物回归试验也证实，该菌株的致病性较强，说明菌株携带毒力因子的多少与致病性强弱有一定相关性。本研究还从菌株WL161中检测到密度感应调控基因LusX，而密度感应系统的存在，对细菌的耐药性和毒力都有一定的影响［11-13］，但LusX 具体调控维氏气单胞菌何种基因，仍有待于深入研究。

图2 基于16Sr RNA 序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree analysis based on 16Sr RNA sequences

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