郭 梅,肖 林,王士磊,曾 健
(解放军第254医院,天津300142)
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,在世界范围内,每年新发病例58万人,27万人死于宫颈癌,其中大约88%的患者处于发展中国家[1]。临床和流行病学研究结果表明,宫颈癌的发生可能与某些病毒感染相关,其中人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为是宫颈癌发生的早期事件之一[2]。目前HPV高危亚型的持续感染可导致宫颈上皮内瘤变和宫颈癌发生的论断已被世界范围内公认。笔者利用DNA杂交技术检测1145例妇科门诊患者宫颈脱落细胞的HPV感染情况,分析HPV及其高危亚型的感染与宫颈癌病变的关系,建立一种适合本地区的快速、准确、适于推广的宫颈癌病变的筛查方法,为临床提供有效的辅助诊断及早期治疗依据。现介绍如下。
1.1 一般资料 2010年4月—2011年6月于我院妇科门诊就诊患者共1145例,年龄18~68岁,均未行子宫切除手术,就诊时处于非妊娠状态。患者同时进行宫颈薄层细胞液基细胞学检查(TCT)和HPV检查,检查前24 h内无性行为,月经干净后3 d检查,且停止阴道冲洗和用药3 d。对2种检查方法同时发现异常的患者进行阴道镜检查并活检。
1.2 试剂 人乳头瘤病毒核酸扩增检测试剂盒由广东凯普生物科技有限公司提供。可一次性快速检测中国人群HPV95%的21种亚型,即13种高危险型(HR-HPV)包括HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,5 种低危险型(HPV 6,11,42,43,44)和 3 种未分高低危亚型(HPV 53、HPV66、CP8304)。
1.3 方法
1.3.1 取材 HPV-DNA标本:暴露宫颈,并拭去宫颈表面分泌物,用专用宫颈刷伸入宫颈外口轻压并依顺时针方向旋转3~4周后,将获取的足量宫颈脱落上皮细胞浸入保存液中-20℃保存,1周内检测。
1.3.2 DNA的提取 将宫颈细胞保存液充分震荡混匀,取800 μL保存液以14000 r/min离心5 min,弃上清液,用 DNA提取试剂盒按说明书取标本DNA。
1.3.3 PCR扩增 取1 μL样品做PCR扩增,采用HPV通用引物,引物序列5’端标记生物素做标记,PCR反应体系:将23.5 μL PCR - MIX、0.75 μL Taq 酶和 1 μL DNA 模板混匀,设置阴、阳性对照。反应条件如下:50℃ 10 min,95℃ 9 min;95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72℃ 30 s,共40 个循环;72℃ 5 min。
1.3.4 杂交和显色 将扩增产物进行95℃ 5 min,快速放入冰浴3 min,取0.5 μL 加入500 μL 杂交液中,在杂交膜上反应10 min,加封阻液反应5 min,用酶标液洗2次,加显色剂显色。
1.3.5 结果判断 肉眼观察检测结果,阳性为蓝紫色圆点,根据杂交膜探针分布的位置,判断阳性点为何种HPV亚型,多个圆点即为多重感染,每次杂交试验均设阴性、阳性对照。
1.3.6 TCT检查 采用TCT新柏式技术,薄层细胞片利用ThinPrep 2000系统制作。阴性结果为未见上皮内瘤变或恶性病变(NILM),阳性结果报告包括鳞状上皮细胞低度病变(LSIL)、鳞状上皮细胞高度病变(HSIL)和宫颈鳞癌(SCC)。
1.4 病理活检报告 分为宫颈炎、上皮内瘤样病变(CIN)(CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)、宫颈鳞癌(SCC),在本研究中CINⅡ、Ⅲ归为一组。根据宫颈有无病变及病变程度分4组:①NILM;②LSIL,包括 CINⅠ;③HSIL,包括 CINⅡ、Ⅲ;④SCC。
1.5 统计学处理 用统计软件SPSS 11.0进行处理,采用卡方检验对计数资料进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 HPV感染与年龄的关系 1145例中检出HPV阳性357例,阳性率为31.2%;分成5个年龄组,其中18~28岁年龄组152例,HPV阳性68例(44.7%);>28~38岁年龄组325例,HPV阳性110例(33.8%);>38~48岁年龄组368例,HPV阳性119例(32.3%);>48~58岁年龄组232例,HPV阳性47例(20.2%);>58~68岁年龄组68例,HPV阳性13例(19.1%)。其中18~28岁年龄组HPV阳性率最高。
2.2 TCT检查各级病变中HPV检测的结果 在HPV检测阳性的 357例患者中,TCT检查阳性 187例,符合率为52.4%,表明在宫颈病变中,HPV检测的敏感性高于TCT。随着TCT检查中宫颈病变程度的增高,HPV和高危型HPV的检出率也随之升高,符合程度越来越好。TCT检查阳性组(包括LSIL、HSIL、SCC)和NILM组相比,HPV和高危型HPV检出率的差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 TCT检查各级病变中HPV检测情况 例(%)
2.3 HPV不同亚型感染与宫颈活检中不同级别宫颈病变的关系 HPV检测与TCT检查同时阳性的187例标本,再进行宫颈病理活检。高危型HPV在各级别宫颈病变中与低危型HPV感染相比,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,单一HPV亚型感染在宫颈病变中随着级别的提高而呈上升趋势,与多种HPV亚型感染相比,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 病理活检报告与HPV感染类型的关系 例(%)
2.4 TCT阳性与病理活检结果比较 TCT检查阳性患者187例,与最终组织活检对照,TCT检查LSIL诊断符合率74.1%(83/112),HSIL及SCC的符合率为80.6%(58/72)和100%(3/3)。表明在TCT检查阳性结果的基础上进行病理活检的最后定性,联合应用,能够明显提高宫颈疾病筛查效率和准确性。见表3。
表3 TCT阳性与病理活检结果比较 例
我国宫颈癌患病率和病死率均约占世界的1/3,每年新增宫颈癌患者13.15万,约有5万例死于宫颈癌。自1995年世界卫生组织宣布HPV是引起宫颈癌病变的首要因素以来,HPV检测作为筛查宫颈癌的手段受到了人们的重视。笔者利用DNA杂交分型技术对本院就诊的女性进行HPV感染亚型检查,可见HPV 16,52,58等高危亚型明显较其他亚型检出率高,结果与文献[3]报道相同。此结果可为今后本地区控制HPV感染及对宫颈病变的早期防治提供依据。
本研究各年龄段的阳性检出率差异有统计学意义,提示HPV阳性检出率和年龄有关系,在18~28岁组最高。随着年龄的增加,阳性检出率在逐步降低,这说明HPV感染有年轻化的倾向,主要可能是由于年轻女性性生活频繁,易受HPV感染,提示对宫颈病变的防治应从年轻女性做起。但大部分HPV感染在性活跃期的年轻女性是暂时的,而35岁以上女性持续感染高危型HPV是导致这个年龄段女性成为宫颈癌高发人群的重要原因,子宫颈的CIN到癌是一个相对较长时间的过程,即宫颈感染HPV到最后发展为宫颈癌,要经历10 a左右时间。因此加大对35岁以上女性HPV感染监测以及宫颈涂片的普查力度,可以进一步减少宫颈癌的发生。
宫颈癌的发生与高危型HPV的持续感染及高病毒载量密切相关[4-5]。本研究结果显示,在宫颈病变的各个阶段,从NILM、LSIL、HSIL到SCC患者中高危型HPV感染率明显高于低危型HPV,可见高危型HPV的定期筛查可以确定是否有高危型HPV持续感染,对识别和监测HPV感染的高危人群、预防宫颈癌的发生、治疗癌前病变以及复发监测都具有重要的临床意义。
TCT是一种高效率、高质量的现代新技术制作的单层细胞涂片,效果清晰、阅片容易,采用TBS系统报告方式,简单明了,使临床医生与病理医生有共同语言,可以进行书面交流。TCT与病理活检相比较,LSIL、HSIL和SCC诊断符合率分别为74.1%,80.6%,100%。TCT检测结果与病理组织学结果有一定相关性,在病变程度高时TCT检查与病理活检符合率高。尽管TCT能提高宫颈细胞学的敏感度及减少假阴性,但由于脱落细胞与活体细胞的特征不完全相同,无组织结构,故脱落细胞不能作为最后的诊断依据,所以,Hesselink等[6]认为单独细胞学筛查宫颈病变是不够的。同样,单一的HPV-DNA检测显然有不足之处。
高危型HPV可导致宫颈癌,但并非所有高危型HPV感染阳性者均会患宫颈癌,即并非所有的宫颈癌患者高危型HPV检测均呈阳性。因此,检测高危型HPV并不可能完全取代宫颈涂片、TCT、宫颈活检等检查,但是高危型HPV检测可以作为细胞学检测的重要补充,在妇女宫颈癌风险评估中起重要作用。进行高危型HPV检测联合细胞学检查对预防宫颈癌的发生更有意义,因此,采用TCT标本进行HPV检测,适用于HPV感染任何时期的诊断,且可避免患者依从性差和标本间的误差。HPV-DNA分型检测联合TCT,可以最大限度地发现宫颈异常细胞的同时,及时发现宫颈癌的诱因,不仅可以分辨出现严重病变的妇女,还可以辨别出将来有可能患病的妇女,使针对该病的高危妇女随访成为可能。这样,可以减少HPV阴性女性的就诊率,在细胞学正常及不典型增生人群中,对预警宫颈细胞癌变倾向,及时发现和预防、治疗早期宫颈癌均有较大意义。HPV-DNA分型检测联合TCT是筛查早期宫颈病变的最佳选择,值得在临床广泛推广应用。
综上所述,在人群的普查中,HPV检测是一种高效、便捷的排查方法;在高危人群的筛查中,高危型HPV联合TCT检测,所用样本为宫颈脱落细胞,取样方便,是一种较好的无创检查方法,与宫颈活检的阳性结果符合度高,适用于宫颈癌前病变的筛查;组织活检可在筛查出的重点对象中使用,确定疾病性质,及早治疗。3种检测手段有机结合使用,能够最大限度地弥补各种单一筛查方法的缺陷,对于判断人群中宫颈病变的发展趋势、预防宫颈癌发生并早期治疗具有重要作用。
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