青藤碱联合甲氨蝶呤对类风湿关节炎患者IL-1，IL-17和TNF-α表达的影响

周 彬，周迎莉，林为民，石 鹏，付 宇，曹家月

(1.解放军第451医院，陕西 西安710054;2.解放军第323医院，陕西 西安710054)

类风湿关节炎(RA)是一种全身性的自身免疫性疾病，与遗传、感染、环境、激素等因素相关，对于其确切病因至今不明。此病在中医学中归属于“痹证”的范畴。RA患者主要表现出慢性进行性关节病变，并以非化脓性、增生性滑膜炎，局部关节反复发作为特点，逐渐导致关节软骨的破坏，最后以关节功能损失而致残。在病变发展过程中，RA患者还常见有骨质疏松、骨质破坏。青藤碱(SN)是由防己科植物青风藤及毛青藤的藤茎中提取的生物碱单体，具有抗炎、镇痛、抗风湿、免疫抑制等药理作用。临床实践证明SN具有治疗RA的作用[1]，但具体机制仍未明确。本研究利用SN联合甲氨蝶呤(MTX)治疗RA患者，观察SN对RA患者外周血IL－1、IL－17和TNF－α表达水平的影响，为阐明相关机制提供参考。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2011年8月—2013年3月于解放军第451医院就诊的RA患者60例，诊断均符合1987年美国风湿病学会RA的分类标准，均为初治者，确诊前均未用激素及免疫抑制剂等药物，无合并其他系统性疾病。将患者随机分为 2组:治疗组30例，男12例，女18例;年龄22～63岁，平均42.5岁;病程(38.4±24.6)个月。对照组 30 例，男 11 例，女19例;年龄24～65 岁，平均 43.1 岁;病程(37.2±21.3)个月。 2组患者的性别、年龄、病程以及治疗前的关节肿胀个数、关节压痛个数、晨僵时间、握力大小、患者评价、医生评价、DAS28评分等基本资料比较均无显著性差异(P均＞0.05)，具有可比性。

1.2 治疗方法 对照组给予甲氨蝶呤(甲氨蝶呤片，上海信谊)10 mg口服，每周1次，连用8周;治疗组在甲氨蝶呤口服治疗基础上服用青藤碱(商品名:正清风痛宁，湖南华纳大药厂有限公司)60 mg/次，2次/d，连用8周。

1.3 观察指标

1.3.1 RA活动性评价 用DAS28指数评价活动度。

1.3.2 临床检查指标 患者于治疗前和治疗8周后各进行1次体检，并记录患者关节肿胀个数、关节压痛个数、晨僵时间、握力大小、患者评价、医生评价、DAS28评分，同时进行红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)等检查。

1.3.3 淋巴细胞的分离 无菌采取服药治疗前RA患者6～8 mL肝素抗凝静脉血，1000 r/min离心5 min，收集血细胞，去血浆后的血细胞用生理盐水重悬，用淋巴细胞分离液密度梯度(2100 r/min，离心25 min)离心，用移液器缓慢吸取白雾状淋巴细胞层，并将淋巴细胞集中于10 mL离心管中备用。

1.3.4 qRT－PCR分析 利用RNA－Solve Reagent试剂盒提取淋巴细胞的总RNA，反转录PCR合成cDNA。定量分析合成引物序列，IL－1 P1:GATCCACACTCTCCAGCTGCA;P2:CAA CCAACAAGTGATATTCTCCATG;IL－17 P3:ACTCCTGGGAAGACCTCATTG;P4:GGCCACATGGTGGACAATCG;TNF－α P5:GGTCCCCAAAGGGATGAGAAGTTC;P6:CCACTTGGTGGTTTGCTACGACG;β－actin P7:TGGCACCACACCTTCTACAA;P8:TCGTCATACTCCTGCTTGCT。采用 DNA Engine Opticon-TM2荧光检测系统和DyNAmo SYBR Green qPCR试剂盒进行基因表达的测定。反应条件为:UNG酶50℃孵育2min，94℃预变性10 min。94℃ DNA变性20 s，引物在50℃退火30 s，72℃延伸30 s，36个循环，72℃后延伸10 min。取3次重复的平均值，用目的基因的拷贝数除以β－actin的拷贝数作为靶基因的相对表达量。

1.4 疗效评定标准 2组各项临床指标的比较采用改善值(治疗前值 －治疗后值)和改善率(改善值/治疗前值 ×100%)，将各项临床指标改善率相加求平均值，以平均改善率进行疗效评价。显效:平均改善率＞75%;有效:平均改善率30%～75%;无效:平均改善率＜30%。

1.5 统计学处理 实验数据采用统计学软件SPSS 13.0分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，2组均数间比较采用t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析和两两比较(LSD)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组疗效比较 见表1。

表1 2组治疗后疗效比较 例

2.2 2组治疗前后主要体征与患者、医生评价比较 治疗后，2组患者各项临床指标都得到显著改善(P均＜0.05)，且治疗组较对照组改善更明显(P均＜0.05)。见表2。

表2 2组治疗前后主要症状及体征变化(±s)

表2 2组治疗前后主要症状及体征变化(±s)

注:①与治疗前比较，P ＜0.05;②与对照组治疗后比较，P ＜0.05;1 mmHg=0.133 kPa。

组别 n 时间 晨僵时间/min 握力/mmHg 关节肿胀数/个 关节压痛数/个 患者评价/分 医生评价/分对照组 30 治疗前治疗后121.23 ±10.0363.27 ±8.07①78.33 ±8.6198.66 ±7.46①14.11 ±2.126.78 ±1.83①13.25 ±3.237.15 ±2.04①6.82±1.984.27 ±1.03①6.77 ±1.874.31 ±1.35①治疗组 30 治疗前治疗后131.23 ±10.7941.27 ±7.27①②72.43 ±7.55113.66 ±6.48①②13.09 ±2.544.63 ±1.65①②14.35 ±2.835.44 ±1.94①②6.71 ±1.863.18 ±1.12①②6.47 ±1.983.01 ±1.23①②

2.3 2组治疗前后各项实验室检查指标比较 2组治疗后DAS28、ESR、RF、CRP均有显著改善，且治疗组改善程度更明显，2组患者治疗后外周血淋巴细胞中IL－1，IL－17和TNF－α的表达下调(P＜0.05)，且治疗组表达水平更低(P均 ＜0.05)。见表3。

表3 2组治疗前后各项实验室检查指标比较(±s)

表3 2组治疗前后各项实验室检查指标比较(±s)

注:①与治疗前比较，P ＜0.05;②与对照组治疗后比较，P ＜0.05。

组别 n 时间 DAS28评分/分 ESR/(mm/h) RF/(IU/mL) CRP/(mg/L) IL－1/(μg/L) IL－17/(μg/L)TNF－α/(μg/L)对照组 30 治疗前治疗后6.78 ±1.464.58 ±1.67①62.35 ±10.1428.78 ±9.87①130.22±12.1547.09 ±10.35①34.23 ±6.5415.89 ±4.33①10.23 ±0.393.40 ±0.41①11.33 ±0.425.62±0.27①16.27 ±0.577.44 ±0.31①治疗组 30 治疗前治疗后6.72±1.723.49 ±1.43①②65.48 ±11.0517.58 ±8.97①②127.68 ±13.7631.28 ±11.06①②32.34 ±6.458.27 ±2.56①②9.87 ±0.361.82±0.29①②12.13 ±0.343.84 ±0.26①②16.81 ±0.465.89 ±0.26①②

3 讨论

目前治疗RA的主要方式包括非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂、自体干细胞移植和基因治疗等[2－4]。这些方式主要通过调节机体免疫以达到减缓病情发展的目的。但各种西药治疗只能治标而无法根除病症，长期服用也易使患者产生依赖性和毒副作用。生物免疫抑制剂如细胞因子抗体具有明确的疗效，但由于其较大的毒副作用以及昂贵的医疗价格等特点限制了在临床上的应用。因此研究治疗效果好、治疗成本低、毒副作用小的传统中药如青藤碱具有重要的现实意义。

ESR、CRP、RF是3个常用的RA临床检测指标，三者在评估RA患者病情状况中有重要作用[5]。有研究者认为在RA疾病活动指标的评价中，DAS28评分的敏感性和特异性要比CRP、ESR、RF好，且DAS28评分与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)增高及 Th17细胞降低具有明显的相关性[6]。本研究结果也证明了青藤碱联合甲氨蝶呤治疗能够改善RA患者中ESR、CRP、RF、DAS28评分等几项临床指标，与周洁如等[6]研究相符。

研究显示细胞因子网络在RA的发病机制中起到重要作用，患者外周血血清和关节滑膜及滑液中显著增高的促炎因子如IL－1、TNF－α等是RA病变持续存在迁延进展的关键[7]。IL－1主要在单核巨噬细胞中合成分泌，也可由内皮细胞、B细胞和活化的T细胞表达生成。IL－1具有促进滑膜细胞和淋巴细胞增殖和分化的能力，同时能促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2和胶原酶。IL－17是RA发病早期炎症因子，由Th17细胞产生，具有很强促炎症作用。IL－17可以上调软骨细胞及滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，增强聚合素酶和胶原酶活性[8]。研究发现IL－1与IL－17之间具有相互促进与相互减弱的交叉调控作用[9]。TNF－α主要由单核巨噬细胞合成，T细胞、B细胞和成纤维细胞也可以合成一部分。TNF－α也具有许多与IL－1相似的作用，引起骨和软骨的吸收破坏，促进成纤维母细胞的增生[10]。本研究显示青藤碱联合甲氨蝶呤治疗能够显著降低RA患者外周血淋巴细胞IL－1、IL－17和TNF－α的表达，且其降低程度要明显大于单独使用甲氨蝶呤治疗组，说明青藤碱可以通过调节淋巴细胞中相关细胞因子的表达进而调节免疫来治疗RA。

近年来研究发现，青藤碱的可能作用机制包括:调控淋巴细胞的免疫功能，抑制炎症反应;抑制病患处细胞如纤维样滑膜细胞炎性因子的释放;抑制滑膜细胞增殖。本研究结果显示，青藤碱联合甲氨蝶呤可以有效改善RA患者的临床症状，并且可以显著降低患者外周血淋巴细胞表达IL－1、IL－17和TNF－α mRNA，显示出青藤碱具有对外周血淋巴细胞免疫功能的调节作用。免疫调节是一种多种细胞和因子参与的复杂过程，因此青藤碱参与免疫调节的具体机制还需进一步探讨。

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