猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆和序列分析

毋艳萍

摘 要：根据Genbank已发表的猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）全基因组序列，设计两对特异性引物，建立了PCV-2全基因组的克隆和序列分析方法，并对甘肃省两个规模化养猪场采集的疑似PMWS病料进行了全基因克隆和序列分析，确定了PCV-2毒株基因序列的变异情况。结果表明，PCV-2核苷酸序列稳定，1株标准株与2株分离株全基因序列均由1 768 bp组成，彼此间序列的同源性达94.0 %～99.8 % ，2个分离株之间同源性达94.2 %～99.8 %；分离株与标准株和Genbank已发表的23株PCV-2毒株参考毒株同源性达92.6 %～100 %。

关键词：猪圆环病毒Ⅱ型；全基因组；序列分析

中图分类号：S852 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）05-0050-04

猪圆环病毒为圆环病毒科、圆环病毒属、单股环状无囊膜的DNA病毒，是已知最小的动物病毒之一[1]。根据其病致性、抗原性及核苷酸序列可分为PCV-1和PCV-2两个血清型。PCV-1无致病性，可以持续感染PK-15细胞，但不引起细胞病变，广泛存在于正常猪体各器官及猪源细胞。PCV-2有致病性，与世界各国发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征密切相关[2]。该病1991年在加拿大首次报道，主要感染5～12周龄仔猪，发病率为20 %～60 %，致死率可达100 %。临床主要表现为渐进性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、黄疸、肝硬变、腹泻，剖检可见淋巴组织退化、间质性肺炎、肝炎及肾炎等症状。除断奶仔猪多系统衰竭综合征以外，猪皮炎与肾炎综合征、猪繁殖障碍疾病、猪呼吸道疾病综合征、肠炎等疾病，也被证实与猪圆环病毒感染有重要关联。自1996年以来，该病呈世界性分布，法国、西班牙、英国、美国、北爱尔兰等国家均报道猪群中存在PMWS。亚洲地区的日本、韩国、中国及台湾省也有发病报道。PCV-2既可水平传播，引起断奶仔猪发病死亡；亦可垂直传播，引起母猪繁殖障碍，给养猪业带来巨大的经济损失，已引起世界各国的广泛重视。

PCV-2基因组全长为1 767 bp或1 768 bp。PCV-1和PCV-2核苷酸同源性为68 %，其基因组结构相似，PCV-2基因组包含11个开放阅读框（ORF1-11），各阅读框之间大小差异悬殊[2]。其中含有两个最大的开放阅读框：ORF1和ORF2，其中ORF1变异很小，同源性为85 %，主要编码与病毒复制有关的Rep蛋白，ORF2变异较大，编码病毒的结构蛋白Cap，此蛋白是病毒衣壳蛋白的主要成分，具有较好的抗原性，因此PCV-2Cap蛋白可作为诊断PMWS的特异性抗原[3]。研究还表明PCV-1与PCV-2有一定亲缘关系，但也发生了较大的变异。

目前PCV-2在国内广泛流行[4]，了解我国不同地区PCV-2毒株间的遗传差异对预防和控制PCV-2的流行具有重要意义。为此对来自甘肃省规模化养猪场采集的疑似PMWS病料进行了全基因克隆和序列分析，确定PCV-2毒株基因序列的变异情况，为甘肃省PCV-2毒株的分子流行病学及毒株来源的研究奠定 基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

PCV-2毒株标准株、甘肃株，分别命名为BZ株、GS1和GS2株，标准株由农业部兽医诊断中心提供的细胞毒；GS1和GS2株均为组织毒，由甘肃省动物疫病预防控制中心提供。

1.1.2 试剂

Taq聚合酶和dNTP购于上海生工生物工程技术服务有限公司；PGEM- T-easy载体试剂盒购于华美生物工程公司；感受态细菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；E.Z.N.A.? Gel Extraction kit DNA凝胶回收试剂盒为美国Omega Bio-Tek公司产品；蛋白酶K购自德国MERCK公司；LB培养基，英国产；X-gal和IPTG为Sigma公司产品；其它常用试剂如组织细胞裂解液、TE、0.5×TBE缓冲液、LB液体培养基、LB固体培养基等均按照《分子克隆实验指南》配制。

1.1.3 仪器

PCR仪；电泳仪、凝胶成像仪；摇床；低温高速离心机；二级生物安全柜等。

1.2 方法

1.2.1 引物

根据GenBank中发表的PCV-2核苷酸全序列，自行设计两对引物A1、A2与B1、B2，此引物分A、B两段通过PCR技术扩增出PCV-2的全基因组。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用前溶解于灭菌的ddH2O，浓度为64 pmol/L，-20 ℃保存。

1.2.2 样品总DNA的提取

根据资料介绍的方法，取肺织或淋巴结组200 mg左右置于研磨器中剪碎并研磨，加入2 mL消化液继续研磨，取已研磨好的待检病料上清100 μL，再加入500 μL消化液和蛋白酶K10 μL，混匀，置55 ℃水浴中消化4～16 h以上（隔一定时间混匀一次）；细胞培养液提取DNA时不用蛋白酶K且无需消化过夜；取上述处理好的样品，加入等体积即600 μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混合液用力颠倒混匀，12 000 r/min 离心10 min；将上清液500 μL转移至另一个新的离心管中，加等体积异丙醇混匀，置液氮中1 min，室温溶化，13 000 r/min 离心15 min；尔后加入1 mL以 75 %冷乙醇13 000 r/min 离心15 min洗涤；弃上清，金属浴55 ℃15 min温育晾干乙醇；加入50 μL灭菌水或TE溶解沉淀，作模板保存备用。

1.2.3 全基因片段的PCR擴增

20 μL反应体系：

在0.5 mLEppendorf管中依次加入以下组分：

1.2.4 A、B段PCR产物的克隆及鉴定

1.2.4.1 PCR产物的回收与纯化

参照E.Z.N.A.? Gel Extraction kit DNA凝胶回收试剂盒说明书进行。

1.2.4.2 PCR产物的连接

将回收的PCR扩增产物分别与PGEM- T-easy载体连接。连接反应的组成为：

1.2.4.3 连接产物的转化

将1.2.4.2中连接后的DNA产物进行转化。步骤简述 如下：

（1）从-70 ℃冰箱中取出感受态细胞，冰浴上溶化，取50 μL加入到连接管中，轻轻混匀，冰浴中放置30 min；

（2）将离心管放入42 ℃水浴中热激30 s，尔后将离心管快速移至冰浴中2 min；

（3）每管加500 μL无菌的LB培养基，混匀后置37 ℃，225 r/min摇床上，培养1 h，使细菌复苏；

（4）每管加入X-gal 10 μL ，IPTG 20 μL，混匀，选择吸取不同体积（一般取400 μL）菌液涂布于含有50 mg/mL Amp的LB琼脂板上，倒置平皿于37 ℃温箱中培养过夜。

1.2.4.4 挑菌鉴定

备齐用具，从Amp LB平板上挑取白色中等大小的菌落，接种于4 mL含Amp的LB液体培养基中，37 ℃，225 r/min摇床培养2～4 h，供保种测序之用。

1.2.4.5 PCR鉴定

将目的DNA按1：5用dd H2O稀释，取2.0 μL作为模板进行鉴定，同时设不加模板的空白对照，反应体系为：

将以上各组分混匀，瞬时离心，在核酸扩增仪中运行以下程序：

95 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，末轮循环后置4 ℃保存。

反应结束后，取12 μLPCR产物于1.5 %琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.2.5 A、B段基因序列的测定

将经PCR鉴定的阳性菌液送上海英骏生物技术有限公司北京实验室测序。每个插入片段从正反两个方向测通后，验证无误，确定为所需基因序列。

1.2.6 A、B段基因序列测定结果的分析

对测序结果用DNAMAN软件进行拼接，获得PCV-2全基因序列，并将测定的3株PCV-2全基因序列和GenBank上已发表的PCV-2参考毒株进行核苷酸同源性分析，绘制相关遗传关系发育树。

2 结果

2.1 PCR擴增结果

2.1.1 A段PCR扩增结果

A段PCR产物于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，在790 bp处有一特异性条带，与预期结果一致（图1）。

2.1.2 B段PCR扩增结果

B段PCR产物于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，在1 012 bp处有一特异性条带，与预期结果一致（图2）。

2.2 A、B段基因的克隆鉴定

扩增的PCR产物经连接转化进行PCR扩增，结果分别在 990 bp和1 212 bp处出现特异性条带，与预期结果一致（图3、图4）。

2.3 A、B段基因的序列测定

A段基因核苷酸序列长度皆为790 bp，B段基因核苷酸序列长度皆为1 012 bp，用DNAMAN软件进行拼接后，获得PCV-2全基因序列长度标准株与甘肃株均为1 768 bp。

2.4 PCV-2全基因序列分析

PCV-2各个分离株之间在进化上存在着某些地理位置上的相关性，分为两大主支[5-7]。一支以北美洲分离株为主，主要为加拿大和美国分离株；另外还有日本、韩国、西班牙、中国及台湾毒株。另一支以欧洲分离株为主，主要为法国分离株，另外有部分中国毒株。全基因核苷酸序列比较结果表明：本研究的2个分离株之间的全基因核苷酸序列同源性在94.2 % ～99.8 %之间，与23个PCV2毒株（EU547460 GS12甘肃、EU418627 TangHe河南、DQ915588 GRE、EU136720 PCV2herd D丹麦、EF592576 HLJ1广东、EF210106 ZheJiang2006、DQ910866 HSH1河北、DQ861902巴西、DQ195679 上海、AY686764 ZJ、AY578327 JS2003 from China、AY556477 HuNan、AY556476 HaiNan、AY556475 GX、AY556474 FJ、AY556473 SD、AY536756 HuZhou0301、AY536755 SX0201、AJ293869英国、AY321982法国）进行同源性分析，同源性达92.6 %～100 %。与（AF520783韩国、DQ397521美国、AY294310 PCV2-JX中国）同源性较差。同源性分析表明，所测定的2个分离株与欧洲株、法国株及部分中国株在同一个大分枝上；而与韩国、美国相对较远。BZ株与AY556473 SD关系较密切，GS1株、GS2株与EU547460 GS12甘肃关系较密切（表1、图5）。虽然并无证据表明不同的毒株免疫原性有差异，但在选PCV2疫苗免疫时，建议尽量使用国内生产的疫苗进行免疫。

3 讨论与分析

3.1 引物的设计

PCV-2的全基因组有两种，1 767 bp和1 768 bp，皆为单股环状DNA。根据基因序列比较，二者的差别在于，其序列在1 040 bp处缺失一个碱基。本试验在设计引物时，设计了A、B两对引物分两段扩增PCV-2全基因序列。A引物对为UA—816 bp至836 bp，引物长度21 bp，DA—1 585 bp至1 605 bp，引物长度20 bp，A对引物扩增从816 bp至1605 bp的基因片段，理论跨度为790 bp；B引物对为UB—1 591 bp至1 609 bp，引物长度18 bp，DB—817 bp至835 bp，引物长度18 bp，B对引物扩增从817 bp至1 591 bp的基因片段，理论跨度为1 012 bp。两对引物都避开了碱基缺失部分，这样在进行PCR扩增时，不论是1 767 bp还是1 768 bp，均能扩增出来。结果证实，本试验建立的方法真实可靠，扩增的标准株与分离毒株全基因序列均为1 768 bp。

有资料表明设计一对引物从同一点向两端采用背对背的方法扩增PCV-2的全基因序列。此方法虽然省去了后期进行的序列拼接，但由于所扩增的目的片段过长，试验中需要反复优化实验条件，PCR过程中极易出现碱基错配现象，难以保证扩增结果的保真度；同时也会造成扩增效率的低下。本试验分A、B两段扩增，目的片段为790 bp和1 012 bp，均在有效扩增范围，碱基错配率极低，重复试验好。况且后期的序列拼接借助DANMAN分析软件进行，不是很繁琐。实验的目的是序列的克隆与分析，保证扩增的碱基序列与模板序列的一致性才是本试验的重点，试验方法可信，试验结果真实、可靠。

3.2 序列的比较分析

本试验通过PCR方法获得了3株PCV-2的全基因序列，和GenBank上发表的PCV-2全基因序列进行核苷酸序列同源性比较，并绘制遗传关系发育树。

3.3 分子流行病学分析

PCV-2的ORF2编码序列比较分析表明，存在着3个主要变异区域（59位～90位，121位～136和190位～210位氨基酸），而其中有2个（59位～90位和121位～136位氨基酸）与免疫表位（65位～87位和113位～147位氨基酸）相关，这些表位暴露于免疫压力下，有可能会发生突变，导致新的毒株出现，这为疾病的预防和控制带来了更大的难度。

本研究的2个分离株与1个标准株，它们与法国株关系密切，而法国是较早发生PCV-2病的国家之一，早在1986年可能就有本病的发生[8-10]。比较的几个法国毒株分离自1995年发病的猪只。而我国乃至我省却是最近几年才有PCV-2病的发生，这可能是由于前些年从欧洲引进猪种，而所引进猪种体内本来就存在PCV-2所致。推测当时（20世纪80年代末90年代初）由于养殖业刚刚起步，饲养规模小、饲养环境较好污染不严重、疾病种类不多，疫苗接种还不频繁，病毒缺乏共刺激等因素，不能导致疾病发生[9]。但病毒在猪体内长期存在，并与宿主共同演化，演化的结果产生了微小的变异。近十年来随着养殖业规模不断扩大，新病不断出现，尤其是豬繁殖与呼吸综合征最近几年的暴发与流行。加之疫苗接种的日龄不断提前、疫苗种类的不断增多。这些因素可能上调了PCV-2在体内的复制，导致了疾病的发生[11-13]。

3.4 PCV-2感染能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、猪繁殖障碍，吸吸道疾病等，且常和PRRSV、PPV、PRV等病毒混合感染造成更大的经济损失，因此研制PCV-2的诊断试剂和疫苗是当务之急。本试验结果明确了目前甘肃省PCV-2流行毒株基因组的分子学特征，毒株间亲缘关系密切，变异度不大。□□

参考文献：（13篇，略）