产纤维素酶芽孢杆菌DS1309的分离鉴定及产酶条件研究

陈 珊，华 梅，刘 迪，赵书博，李 凡，刘东波，夏红梅

(东北师范大学 生命科学学院，吉林 长春130024)

纤维素是由吡喃型D－葡萄糖以β－1，4－糖苷键连接而成的直链大分子，是自然界中最广泛存在的一类碳水化合物，也是地球上最丰富的再生资源。利用生物技术对植物纤维素进行生物转化以生成人类急需的能源和化工原料等，将对缓解人类社会环境污染、食物短缺和能源危机等具有重大意义［1］。微生物所产生的纤维素酶的降解作用是纤维素资源开发利用的有效途径，这些纤维素酶主要包括:内切葡聚糖酶(endo－l，4－β－D－glucanase，EC3.2.l.4)、外切葡聚糖酶［纤维二糖水解酶(l，4－β－D－glucan cellobiohydrolase，EC3.2.l.9l)和纤维糊精酶(cellodextrinase，EC3.2.l.74)］及β－葡萄糖苷酶(β－glucosidase，EC3.2.1.21)［2］。

产纤维素酶的微生物广泛分布于真菌、细菌、放线菌等菌属中，之前的研究多集中在木霉属和青霉属等真菌方面，但研究结果显示虽然这些真菌产生的纤维素酶种类较多，活力较高，但仍然不能满足实际生产的需求，特别是真菌在降解纤维素时还具有培养周期长、易染菌、耐碱性差、难以实现大工业生产等不足。近年来，陆续出现了细菌降解纤维素的报道，产芽孢细菌因具有特化的芽孢，在耐酸碱、耐高温等方面显现了独特的优势［3］，更利于实际操作和工业生产，因此成为目前纤维素降解微生物研究的重要方向。

本文从长白山森林土壤中筛选到了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，对其进行了分类鉴定，并研究了菌株产纤维素酶的最佳条件，为该菌的进一步应用及对纤维素的有效转化提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 培养基

1.1.1 富集培养基

羧甲基纤维素钠(CMC－Na)，1%;Mandels 无机营养盐液［4］;蛋白胨，1%;琼脂粉，1.5%;自然pH。

1.1.2 筛选培养基

CMC－Na，1%;Mandels 无机营养盐液;琼脂粉，1.5%;自然pH。

1.1.3 产酶发酵培养基

CMC－Na，1%;NaCl，0.5%;KH2PO4，0.1%;MgSO4，0.02%;蛋白胨，1%;pH 7.2。

1.2 菌株的分离筛选

采集长白山森林土壤，置于无菌水中振荡，打散后取上层水样接入富集培养基中，连续富集培养3 次后，将上清液梯度稀释涂布或划线于筛选培养基平板上30℃培养至菌落长出，经刚果红染色、NaCl 脱色后，观察菌落周围是否有透明圈生成，并测定透明圈直径与菌落直径的比值，选取比值较大的菌株接种到产酶培养基中，测定发酵液的酶活性。

1.3 CMC 酶活力的测定

取1.5 mL 0.05mol/ L 缓冲液配制的1.0% CMC 溶液，加入0.5mL 适当稀释的酶液，50℃反应30min 后用DNS 法测定酶解产生的还原糖量，酶活单位采用国际单位(International Unit，IU)，即在实验条件下1 mL 酶液1 min 产生1?mol 还原糖的酶量作为1 个酶活单位U［5］。

1.4 菌株的鉴定

形态学鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》［6］进行。分子生物学鉴定及进化分析依据该菌株的16S rDNA 序列，具体方法为首先提取菌株的基因组DNA［7］，以该基因组为模板扩增菌株的16S rDNA。所用PCR 引物为细菌鉴定通用引物:27F 5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇，1492R 5＇－ACGGCTACCTTGTTACGACT－3＇。PCR 反应程序:94℃4 min;94℃1min，55 ℃30 s，72℃2min，30 个循环;72℃10min。PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带回收后与PMD－18T 载体连接送长春库美测序公司测序，测序结果在NCBI 进行BLAST 分析，以ClustalX 进行多序列比对后，采用MEGA4.0 的Neighbor－Joining 法构建系统发育树。

1.5 发酵温度对菌株产酶的影响

将2ml 种子液接入产酶培养基中，分别置于25℃、30℃、37℃、40℃和45℃摇床中振荡培养，间隔12h取样。将发酵液样品在8000rpm 条件下离心10min，所得上清液即为粗酶液。测定不同粗酶液样品的CMC 降解活性，选取不同温度下达到产酶高峰时的酶活性做比较，以最高活性为100%，其余活性换算为相对活性作图，研究不同发酵温度对菌株产酶的影响。

1.6 培养基初始pH 对菌株产酶的影响

配制初始pH 分别为5、6、7、8、9 的产酶培养基，接种后在测得的最适培养温度下振荡培养，间隔12h取样。将发酵液样品在8000rpm 条件下离心10min，测定上清液的CMC 降解活性，选取不同初始pH 培养基中达到产酶高峰时的酶活性做比较，以最高活性为100%，其余活性换算为相对活性作图，研究培养基不同初始pH 对菌株产酶的影响。

1.7 碳源对菌株产酶的影响

改变产酶培养基中的碳源种类，浓度均采用1%，接入2ml 种子液后置于最适培养温度下摇床振荡培养，达到产酶高峰后测定不同碳源条件下粗酶液的CMC 降解活性，研究不同碳源对菌株产酶的影响。

1.8 氮源对菌株产酶的影响

分别选取典型的有机氮和无机氮作为产酶培养基中的氮源，浓度均采用1%，接入2ml 种子液后置于最适培养温度下摇床振荡培养，达到产酶高峰后测定不同氮源条件下粗酶液的CMC 降解活性，研究不同氮源对菌株产酶的影响。

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选

以CMC－Na 为唯一碳源进行菌种筛选，待细菌在平板上生长后，用0.1%的刚果红水溶浸染15min，再用1M 的NaCl 水溶液脱色。刚果红可将CMC－Na 染成红色，而纤维素降解菌株周围由于分泌的纤维素酶使CMC 降解为小分子糖不着色，因此可以明显的观察到透明圈的存在(图1)。应用本方法成功的从长白山森林土壤中筛选到了多株对CMC 具有降解活性的菌株，选择其中的芽孢杆菌DS1309 做为进一步的研究对象。

图1 刚果红染色后菌株周围形成的透明圈

2.2 菌种的鉴定

菌株DS1309 在CMC 培养基及普通细菌培养基上生长菌落呈污白色，干燥，粗糙，不透明，中间凸起。菌体在显微镜油镜下观察呈杆状，产芽孢，革兰氏染色为阳性，显微形态图见图2。

在形态学观察的同时对菌株进行了分子生物学鉴定。菌株16S rDNA 序列分析结果表明，该菌株的16S rDNA 序列与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)16S rDNA 序列的同源性高达99%，将相关序列通过ClustalX 进行多序列比对后，利用MEGA4.0 软件构建系统发育树，结果显示在系统发育上菌株DS1309与地衣芽孢杆菌属于同一分支。根据形态学观察和分子生物学鉴定结果，确定该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

2.3 地衣芽孢杆菌DS1309 产酶条件的研究

2.3.1 培养温度对菌株产酶的影响

将2ml 种子发酵液接种于产酶培养基中，置于不同温度下振荡培养，间隔12h 取样测定上清液的酶活性。结果显示在30℃左右菌体生长旺盛，发酵液酶活力最高(图3)，因此确定菌株DS1309 产纤维素酶的最适发酵温度为30℃。

图2 菌株DS1309 的显微形态图

图3 培养温度对菌株产酶的影响

2.3.2 培养基初始pH 对菌株产酶的影响

制备产酶培养基分装至三角瓶中，分别调节培养基的pH 为5、6、7、8 和9，接入2ml 种子液后，置于最适温度30℃下培养，间隔12h 取样测定上清液的酶活性，选取达到产酶高峰时的酶活性作图。由图4可知，初始发酵pH 对菌株产酶的影响比较明显，在pH6.0 范围内，随着初始pH 的升高，CMC 降解酶活力增强，pH 为6.0 时菌株所产酶活力最高;pH 进一步升高后，发酵液酶活力迅速降低，在pH7.0 时酶活力仅为pH6.0 培养基中活力的40%，说明菌株DS1309 产纤维素酶的最适发酵初始pH 为6.0。

图4 培养基初始pH 对菌株产酶的影响

2.3.3 不同碳源对菌株产酶的影响

分别选取CMC－Na、葡萄糖、蔗糖、麸皮和玉米秸秆作为产酶培养基中的碳源，研究不同碳源对菌株产酶的影响。结果(图5)表明菌株DS1309 对碳源利用广泛，除了能够以CMC－Na 为碳源外，还能够利用单糖、双糖及麸皮、玉米秸秆等天然纤维素。碳源对菌株产纤维素酶的影响顺序为葡萄糖＞蔗糖＞麸皮＞玉米秸秆＞CMC－Na，最佳利用碳源为葡萄糖。同时研究也显示出，以葡萄糖和蔗糖为碳源时，产酶高峰出现较晚，推测当培养基中单糖和双糖浓度较高时，有利于菌株的生长，但是对菌株产酶有产物抑制作用;随着碳源的利用，糖浓度降低，抑制作用解除，纤维素酶产量迅速提高。

2.3.4 不同氮源对菌株产酶的影响

分别选取有机氮蛋白胨、酵母粉，无机氮NH4NO3、(NH4)2SO4 以及提供无极氮形式的有机物尿素作为氮源，研究不同氮源对菌株产酶的影响。结果(图6)表明有机氮作为氮源的条件下，菌株发酵液的酶活力较高，最佳的氮源为酵母粉。同时结果还表明菌株能够利用硝酸盐生长并产酶，但对于铵盐形式的无机氮源利用较差。

图5 碳源对菌株产酶的影响

图6 氮源对菌株产酶的影响

3 结 语

本文采用唯一碳源法从长白山森林土壤中筛选到了一株具有纤维素降解酶活力的芽孢杆菌DS1309，根据菌株的形态学观察结果和16SrDNA 的系统发育分析，鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。采用液体振荡培养的方法，优化了菌株DS1309 产CMCase 的发酵条件，结果显示，菌株产酶的最适培养温度是30℃，培养基最适初始pH 为6.0，产酶的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母粉，在最优条件下发酵48h 后酶活可达到1.82 IU/mL。

［1］SunY，ChengJ.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol Production:a review［J］.Bioresour Technol，2002，83:1－11.

［2］王凤超.未培养微生物来源的纤维素酶功能基因的筛选［M］.济南:山东大学硕士学位论文，2008.

［3］Trivedi N，Guota V，Kumar M，et al.An Alkali－halotolerant Cellulase from Bacillus flexus Isolated from Green Seaweed Ulva lactuca［J］.Carblhydrate polymers，2011，83:891－897.

［4］高培基，曲音波，王祖农.纤维素酶解过程的分析和测定［J］.生物工程学报，1988，4(4):321－325.

［5］姚强，黄琰，陈冠军.产耐碱性纤维素酶丝状真菌的筛选及鉴定［J］.山东大学学报，2005，40(1):119－124.

［6］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001.

［7］F.M.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，等.精编分子生物学实验指南［M］.北京:科学出版社，2008.