QF-PCR筛查男性不育患者Y染色体无精子症因子微缺失

张媛媛, 杜强, 刘晓亮, 崔婉婷, 何蓉, 赵彦艳

1. 中国医科大学附属盛京医院临床遗传科, 沈阳 110004;

2. 中国医科大学附属盛京医院生殖中心, 沈阳 110004

QF-PCR筛查男性不育患者Y染色体无精子症因子微缺失

张媛媛1, 杜强2, 刘晓亮1, 崔婉婷1, 何蓉1, 赵彦艳1

1. 中国医科大学附属盛京医院临床遗传科, 沈阳 110004;

2. 中国医科大学附属盛京医院生殖中心, 沈阳 110004

为评估定量荧光PCR(Quantitative fluorescent polymerase chain reaction, QF-PCR)技术在快速筛查无精子症因子(Azoospermia factor, AZF)微缺失中的应用, 文章对1218例非梗阻性无精子症、少精子症的男性不育患者, 采用多重QF-PCR结合毛细管电泳技术, 检测Y染色体长臂AZF区9个序列标签位点(Sequence tagged site, STS)以及性染色体短臂的AMEL(Amelogenin)和SRY(Sex-determining region of Y chromosome)位点, 辅以常规染色体G显带方法进行核型分析。结果显示, 1218例患者中105例可见AZF区微缺失(8.62%), 其中AZFc区缺失(67.62%)最常见, 其次为AZFb,c区缺失(20.95%); AZFb区缺失(7.62%)和AZFa区缺失(3.81%)则较少见; 另有5例患者为AZFa,b,c区缺失合并AMEL-Y缺失, 提示可能缺少Y染色体, 经核型分析验证为46,XX(性反转)。105例AZF区微缺失患者的染色体核型分析显示染色体异常16例, 其中“Yqh-”12例。根据AMEL-X/AMEL-Y比值, 可见 1218例患者中 86例可能存在性染色体异常, 经核型分析验证, 68例为性染色体非整倍体。多重QF-PCR技术, 一个反应即能检测样本的多个位点, 并可提示性染色体是否存在异常, 有助于男性不育患者尽早明确病因, 也为后续的检查和治疗提供依据。

无精子症因子; 微缺失; Y染色体; 定量荧光PCR; 男性不育症

不育症困扰着世界上超过 10%的育龄夫妇, 其中男性因素占了一半[1]。引起男性不育的病因有很多, 包括感染、生殖器官畸形、免疫功能异常、精索静脉曲张、勃起机能障碍、药物损伤以及染色体异常等。男性不育常伴随着精子数量减少, 国内学者已对其进行了大量相关研究[2～4]。Y染色体长臂无精子症因子(Azoospermia factor, AZF)微缺失是导致男性生精障碍主要的遗传学因素之一。研究表明,亚洲地区男性不育患者中 AZF微缺失的发生率在2%～19.4%之间[5], 与研究对象纳入标准、STS位点选择、人群分布及遗传背景有关。AZF区微缺失的患者极少有自然生育能力, 但近年来睾丸取精(Testicular sperm extraction, TESE)和卵母细胞质内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技术的发展, 给无精子症、少精子症患者能够生育带来了希望, 但也增加了将微缺失传递给下一代的风险。因此, 对男性不育患者尽早进行 Y染色体微缺失筛查有着重要意义, 不仅可以明确患者真正病因, 避免不必要的检查及无效的治疗, 还可预知或者防止遗传缺陷的传递。

本研究采用定量荧光PCR(Quantitative fluorescent polymerase chain reaction, QF-PCR)技术[6], 通过毛细管电泳, 对我国北方非梗阻性无精子症、少精子症的男性不育患者Y染色体AZF区的9个序列标签位点(Sequence tagged site, STS)进行检测, 并将X、Y染色体短臂特异性位点 AMEL(Amelogenin, Xp22.22/ Yp11.2)和 Y 染色体短臂特异性位点 SRY(Sexdetermining region of Y chromosome, Yp11.3)作为内对照, 以了解 Y染色体微缺失情况, 并对发生微缺失的患者进行染色体核型分析, 以探讨 Y染色体微缺失与Y染色体结构异常的关系, 评估多重QF-PCR在AZF微缺失检测中的应用。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2012年1月～2013年7 月于中国医科大学附属盛京医院辅助生殖门诊就诊的非梗阻性无精子症(n=852, 精子浓度为 0×106/mL)、重度少精子症(n=272, 精子浓度为0～5×106/mL)和轻度或中度少精子症(n=94, 精子浓度为 5～20×106/mL)患者共 1218例。患者年龄在 19～55周岁之间, 均已征得知情同意。精液分析参照WHO标准[7]。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用Chelex-100法提取基因组DNA, 具体操作如下：取20 μL全血加入到1 mL灭菌蒸馏水中, 震荡混匀, 12 000 r/min离心2 min, 吸弃上清; 沉淀中加入100 μL 5% Chelex-100溶液, 剧烈振荡, 56℃水浴30 min; 取出涡旋10 s, 100℃煮沸8 min, 再涡旋10 s, 12 000 r/min离心4 min; 取上清用于PCR扩增。

1.2.2 多重QF-PCR技术

引物设计：选取欧洲男科学协会/欧洲分子遗传实验质控系统关于Y染色体微缺失分子诊断操作指南[8]推荐的AZF区6个STS位点sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255, 以及sY145、sY152和sY157作为检测位点, 将AMEL和SRY位点作为内对照。所有引物序列均来自指南[8]或 NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/unists), 其中sY84位点的引物序列稍作修改(F：5′-GGTTCCTGATTTCACCCTTT-3′; R：5′-CCCATGTTTCGTGCAGATTA-3′)。将所有检测位点的上游引物5′端标记荧光, 引物由Invitrogen公司合成。

反应总体积25 μL, 包括1×TranStartTMTaq Buffer (TransGen Biotech), 0.2 mmol/L dNTP, 11对引物的混合液2.5 μL, 1.25 U TranStartTMTaq DNA polymerase (TransGen Biotech), 基因组DNA 50～100 ng。PCR扩增条件：95℃预变性5 min; 94℃ 45 s, 56℃ 45 s, 72℃ 45 s, 共30个循环; 最后72℃延伸30 min。

检测及分析：取 0.5 μL PCR产物与 0.5 μL Genescan LIZ 500(Applied Biosystem)以及 10 μL Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystem)混合, 95℃变性 5 min, 迅速冰浴冷却, 经基因分析仪(ABI genetic analyzer 3730)毛细管电泳, 按片段大小分离, 原始数据由GeneMapper v4.1软件(Applied Biosystem)分析。已育男性(阳性对照)各检测位点均有预期大小片段, 正常女性(阴性对照)仅有 AMEL-X扩增片段,空白对照(灭菌蒸馏水)则无扩增。若待检样本所有位点均有扩增提示无缺失; 若待检样本部分位点无扩增, 则重提DNA进行重新检测, 并针对缺失位点进行单个位点的扩增检测, 如检测结果一致提示相应区域有缺失。

1.2.3 染色体核型分析

取肝素抗凝的外周血, 常规方法培养淋巴细胞,制备中期染色体, G显带核型分析3～5个细胞, 计数20个细胞, 遇到染色体嵌合体时计数加倍。

2 结果与分析

2.1 多重QF-PCR检测

对1218例男性不育患者进行Y染色体AZF区微缺失筛查, 检出异常病例如下：

2.1.1 AZF区微缺失105例, 检出率8.62%

1218例患者中有105例可见AZF区一个或多个检测位点缺失。其中, AZFc区缺失最常见, 占缺失患者总数的67.62%, 其次为AZFb,c区缺失(20.95%); AZFb区缺失(7.62%)和AZFa区缺失(3.81%)则较少见(表1)。

2.1.2 46,XX (SRY+/‒)性反转5例, 检出率0.41%

5例患者 AZF区各检测位点均显示缺失, 并且AMEL位点仅有AMEL-X扩增片段, 提示可能缺少Y染色体, 经核型分析验证染色体核型均为46,XX。此外, QF-PCR检测结果显示这5例患者中有4例患者SRY基因扩增呈阳性峰, 另1例患者SRY基因未见扩增。

2.1.3 无精子症和少精子症患者Y染色体AZF区微缺失发生率

852例无精子症患者中检出 AZF区微缺失 81例(9.51%), 包括AZFa区、AZFb区、AZFb,c区缺失的患者共34例, 以及AZFc区缺失的患者47例。272例重度少精子症患者以及94例轻度或中度少精子症患者中检出AZF区微缺失分别为22例(8.09%)和2例(2.13%), 并且这些患者均为AZFc区缺失。

表1 Y染色体AZF微缺失检测异常结果

2.1.4 AMEL异常86例, 检出率6.90%

正常男性个体AMEL位点可以扩增出两条片段AMEL-X和AMEL-Y, 且AMEL-X与AMEL-Y片段的荧光峰峰高或峰面积比值在0.8～1.4之间。本研究中有65例(5.34%, 65/1218)患者AMEL-X/AMEL-Y为1.6～2.1, 提示这些患者性染色体可能为X增多或Y减少, 核型分析验证均为 47,XXY; 21例(1.72%, 21/1218)患者AMEL-X/AMEL-Y为0.4～0.6, 提示其性染色体可能为Y增多或X减少, 而核型分析显示仅有3例患者的性染色体有数目异常(表2)。

表2 AMEL位点异常患者的核型分析结果

2.2 染色体核型分析

105例AZF区微缺失患者的染色体核型分析结果显示：15例(14.29%)患者可见性染色体异常(表3); 1例患者为15号染色体随体小; 其余89例患者的染色体核型均为 46,XY。值得注意的是, 异常核型中“Yqh-”较多见(75.0%, 12/16); 另外, AZFb,c区完全缺失的 15例患者中有 12例(80%)染色体核型显示异常。

表3 Y染色体AZF微缺失患者核型分析异常结果

3 讨 论

1976年, Tiepolo和Zuffardi[9]在对无精子症患者进行细胞遗传学检测时发现 Yq11区域存在多个与精子发生相关的因子, 称为无精子症因子(AZF)。随后的研究指出, AZF可分为3个亚区：AZFa区、AZFb区和 AZFc区, 其中一个或多个亚区缺失会导致少精子症、无精子症或畸形精子症[10]。很多文献报道了各地男性不育人群Y染色体AZF微缺失的情况,并一致认为 AZFc区是最常发生断裂的区域[11]。本研究对中国北方 1218例男性不育患者进行了 AZF区微缺失筛查, 发现总缺失率为8.62%, 这与Zhang等[12]报道的中国北方吉林地区 1738例不育患者AZF微缺失的发生率(8.57%)一致。同样, 本文也发现缺失发生在AZFc区的患者最多, 包括AZFc区缺失71例以及AZFb,c区缺失22例。在AZFc区缺失的患者中, sY152、sY157、sY254和sY255位点缺失是主要缺失类型; 而在 AZFb,c区缺失患者中, sY127、sY134、sY145、sY152、sY157、sY254和sY255位点均无扩增则较常见。微缺失的患者中还有5例为单个位点缺失, 分别涉及sY134、sY152和sY157位点, 提示可能存在相应区域的部分缺失。由于单个位点缺失的情况很罕见, 本文对这几例样本均进行了仔细复核。另外, 鉴于 Wu等[13]证明欧洲指南推荐的 sY84下游引物序列在中国人群中存在单核苷酸多态(rs72609647), 本研究以这对 sY84引物扩增的序列为中心又重新设计了一对引物应用于临床检测, 以避开此多态位点, 以免出现sY84单缺的假阳性结果。本研究还发现5例性反转(46,XX)患者, 其中有4例经QF-PCR检测SRY基因扩增为阳性, 尽管在核型分析时加大了中期分裂相计数(≥40个), 但尚未发现嵌合体的情况。鉴于本实验室在前期研究工作中[6]也发现过 2例性反转患者, 其 SRY基因均有扩增, 染色体核型分别为 46,XX 和46,X,der(X),t(X;Y)(p22;p11), 因此, 本文推测这4例患者可能发生了包含SRY基因的染色体微小片段易位, 需依靠高分辨核型分析或基于芯片技术的比较基因组杂交(Array-based comparative genomic hybridization, aCGH)技术进一步验证。

结合患者的精液检查结果发现, 本研究中无精子症和重度少精子症的患者较多, 分别为 852例和272例, 而轻度或中度少精子症的患者有94例, 3组人群AZF微缺失率分别为9.51%、8.09%和2.13%,与国内一些实验室报道的数据相符[3,12,14～15]。此外,发生AZFa区、AZFb区或AZFb,c区缺失的患者均显示为无精子症, 而AZFc区缺失的患者有47例为无精子症, 22例为重度少精子症, 还有2例为轻度或中度少精子症。这些结果验证了AZF区微缺失基因型与男性不育的表型及严重程度的关系：AZFa区缺失可表现为唯支持细胞综合征(Sertoli cell-only syndrome, SCOS)[16], 为绝对的无精子症; AZFb区缺失会导致生精阻滞, 或发展为 SCOS[16]; AZFc区缺失的临床表现则不尽相同, 该区有很多与不育相关的基因, 如DAZ基因簇有多个功能拷贝[17], 这些基因缺失或拷贝数改变可表现为正常、少精子症甚至无精子症[18]。值得注意的是, 在 5例单个位点缺失的患者中, 除有 1例为重度少精子症外(sY157单缺),其余均为无精子症, 提示sY152和sY157位点的单独缺失与男性不育患者的无精子症、少精子症也可能相关。目前, AZFc区缺失的部分无精子症患者通过睾丸取精技术可以获得精子, 与少精子症患者均有机会生育下一代[19], 但同时也会将缺陷遗传给男胎, 因此需要充分告知患者, 并建议其男性后代在生育期进行遗传咨询。另外, 有研究发现AZFc区缺失的少精子症患者的精子数目有进行性下降的趋势,最后可能发展为无精子症[19], 因此, 对于这一部分患者应及早进行治疗或将其精液进行冷冻保存。

从微缺失患者的染色体核型分析可以看出, 除了 AZFa区缺失的患者染色体均正常外, 其余缺失类型的患者均有Y染色体异常的情况。最常见的就是“Yqh-”(11.43%, 12/105), 其中多数患者(75.0%, 9/12)为AZFb,c区完全缺失, 超过发生该缺失类型患者人数的一半(60.0%, 9/15); 另有2例为“inv(Y)”,可见, 发生微缺失的患者其 Y染色体结构也可能是异常的, 且缺失的范围越大, 其异常率越高。另外,从AMEL-X与AMEL-Y片段荧光峰峰高或峰面积的比值也可以初步判断性染色体是否异常。经染色体核型分析验证之后, 对于X增多的情况, AMEL位点能准确的给出提示, 但是, 对于AMEL提示的Y增多或X减少, 只有3例(14.29%, 3/21)与核型分析的结果相符, 其余18例患者性染色体未见异常, 推测可能是AMEL-Y区域发生了微小重复突变。Murphy等[20]也曾有类似报道, 研究中的兄弟二人AMEL-X/AMEL-Y比值均约为 1:2, 但为正常男性核型, 表型也无特殊、无不育的相关病史, 利用比较基因组杂交技术(Comparative genomic hybridization, CGH)验证发现Y染色体短臂发生2.6～4 Mb区域的重复突变, 该区域包括AMEL、PRKY和TBL1Y等基因。但这一突变是否为多态或与男性不育是否有关还需进行深入地研究, 但值得注意的是本研究发现21例AMEL-X/AMEL-Y约为1:2的患者中有10例患者发生了AZFb区或AZFb,c区缺失。

与普通的 PCR-琼脂糖凝胶电泳相比, 多重QF-PCR技术结合毛细管电泳筛查Y染色体AZF微缺失具有以下优点：(1)一个反应即可检测样本的多个位点, 凭借基因分析仪高通量的优势可同时进行多个样本检测, 大大减少了劳动强度, 能更简便,快速的分析各位点扩增情况; (2)QF-PCR利用荧光标记引物以及扩增片段长度的不同, 可避免因非特异性扩增或扩增不完全造成的假阳性和假阴性结果,提高了检测的准确性和特异性; (3)毛细管电泳的分辨率可达1 bp, 可清楚的区分AMEL-X与AMEL-Y扩增片段, 有助于提示性染色体异常, 指导患者进行染色体核型分析确诊并与核型分析的结果相互验证, 这是普通PCR-琼脂糖凝胶电泳无法完成的。不足的是, QF-PCR与毛细管电泳技术所需检测设备及相关试剂费用较高, 增加了检测成本, 因此限制了它在临床上的广泛应用。另外, 对于本研究中 AZF区微缺失样本, 均重提DNA进行重新检测, 并进行缺失位点单独扩增检测, 各样本几次检测结果均显示一致, 说明 QF-PCR的敏感性较高, 重复性较好; QF-PCR也能辅助核型分析诊断性反转患者, 区分46,XX(SRY+)和 46,XX(SRY-)以及核型无法识别的微小易位。当然, 本研究还有一定的局限性, 对于有多个拷贝的基因位点, 只能检测其有无, 而无法检测拷贝数的改变, 因此, 在以后的研究工作中, 会针对Y染色体长臂AZF区与常染色体同源的序列设计引物, 进行半定量分析, 完善AZF区部分缺失/重复的检测。

对于男性不育症以及准备进行辅助生育的夫妇来说, Y微缺失检测已经成为一项常规的检查项目,本研究应用多重QF-PCR技术结合毛细管电泳可以简便、快速地检出微缺失患者, 同时提示性染色体异常, 便于患者尽早明确病因, 为后续的检查和治疗提供依据, 也对优生优育具有重要的指导意义。

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(责任编委: 史庆华)

Screening of azoospermia factor microdeletions on Y chromosome in infertile men by QF-PCR

Yuanyuan Zhang1, Qiang Du2, Xiaoliang Liu1, Wanting Cui1, Rong He1, Yanyan Zhao1

1. Department of Clinical Genetics, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China;
2. Center of Reproductive Medicine, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China

To assess the application of quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) on rapid screening of azoospermia factor (AZF) microdeletions, 1218 infertile men with non-obstructive azoospermia or oligospermia were detected for 9 sequence tagged sites (STSs) in AZF region by multiplex QF-PCR combined with capillary electrophoresis.AMEL (amelogenin) as well as SRY (sex-determining region of Y chromosome) located on short arm of sex chromosome was selected as internal control. Karyotyping was performed on Giemsa-banded metaphase chromosomes of peripheral blood lymphocytes. Of the 1218 patients, 105 (8.62%) were identified as AZF microdeletions. Deletion of AZFc (67.62%) was the most frequent, followed by deletion of AZFb,c (20.95%), AZFb (7.62%) and AZFa (3.81%). Five patients presented with deletions of both AZFa,b,c and AMEL-Y, indicating sex reversal which was confirmed to be 46,XX by karyotyping. Among the 105 patients with AZF microdeletions, 16 were karyotyped as chromosomal anomalies, most commonly 46,XY,Yqh- (75%, 12/16). In addition, of the total 1218 patients examined, 86 patients showed abnormal AMEL-X/AMELY ratio, suggesting a possibility of sex chromosome anomalies, and 68 of them were verified as sex chromosome aneuploid by karyotyping. Multiplex QF-PCR is capable to detect all markers in one reaction and is also suggestive for sex chromosome anomalies. It could serve as an effective technique for screening Y-microdeletions, and thus have general application in diagnosis and treatment of male infertility.

azoospermia factor; microdeletion; Y chromosome; quantitative fluorescent polymerase chain reaction; male infertility

2013-12-17;

2014-02-12

国家自然科学基金项目(编号：81270343，81100187)资助

张媛媛, 博士, 研究方向：复杂疾病的分子遗传学。Tel: 024-96615-75311; E-mail: zyy.0526@163.com

赵彦艳, 博士, 教授, 研究方向：复杂疾病的分子遗传学。E-mail: yyzhao@sj-hospital.org

10.3724/SP.J.1005.2014.0552

时间: 2014-5-5 8:54:10

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140505.0854.006.html