乳腺癌组织HIF-1α和Sema 4D表达及其与淋巴管密度和各临床病理指标的关系

杨小敏潘 丹陈艳梅郑 翔冯国飞徐晓武

1浙江省温州市人民医院病理科 温州 325000 2温州医科大学附属第二医院胃肠外科

乳腺癌组织HIF-1α和Sema 4D表达及其与淋巴管密度和各临床病理指标的关系

杨小敏1潘 丹1陈艳梅1郑 翔1冯国飞1徐晓武2

1浙江省温州市人民医院病理科 温州 325000 2温州医科大学附属第二医院胃肠外科

目的 通过检测HIF-1α和Sema 4D在乳腺癌组织表达，探讨其与淋巴管密度（LVD）和临床病理指标的关系。方法 采用免疫组化SP法检测110例乳腺癌组织标本HIF-1α和Sema 4D表达，检测微淋巴管密度（LVD），依据不同临床病理特征分组并进行组间比较，并与乳腺纤维腺瘤组织标本对照。结果 乳腺癌组织HIF-1α和Sema 4D阳性表达率分别为72.72%（80/110）和77.27%（85/110）；HIF-1α与Sema 4D表达呈正相关性（r=0.691，P＜0.01）。乳腺癌组织LVD显著高于纤维腺瘤组（P＜0.01），淋巴结转移组LVD显著高于无淋巴结转移组（P＜0.01）；pTNMⅠ～Ⅱ期组、淋巴结无转移组癌组织HIF-1α和Sema 4D表达阳性率明显低于pTNMⅢ期组、有淋巴结转移组（P＜0.05，P＜0.01），不同年龄、组织学分级、肿块大小组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 乳腺癌组织HIF-1α、Sema 4D高表达，可能与淋巴管的增生、转移侵袭有密切关系。

乳腺癌；缺氧诱导因子-1α；轴突导向因子4D；淋巴管密度

图1 A：HIF-1α在癌细胞核表达（HE ×200）；B：Sema4D在癌细胞浆表达（HE ×200）

图2 乳腺癌组织D2-40表达阳性的淋巴管（HE ×200）

缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是肿瘤细胞缺氧适应的中心调节因子，在多种人类恶性肿瘤早期即发现HIF-1α的过度表达，与肿瘤生长、血管形成、转移有关[1]。轴突导向因子4D（semaphorin4D，Sema4D）是Semaphorin超家族成员之一，对肿瘤血管发生及侵袭转移起重要作用[2]。本研究旨通过观察乳腺癌组织HIF-1α和Sema 4D表达情况，探讨其与淋巴管密度（LVD）和临床病理指标的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2003年—2007年在我院行乳腺癌改良根治术，临床资料齐全的女性患者110例，年龄32～68岁，平均46.4岁；术前均未行放化疗及其他治疗手段。所有患者的病理切片均由2位病理科医师独立复阅，确诊110例均属浸润性导管癌；其中直径＜3cm 81例，直径≥3cm 29例；清除淋巴结数均＞15枚；腋窝淋巴结转移63例，无腋窝淋巴结转移47例。按国际病理学分级标准[3]：Ⅰ级30例，Ⅱ级47例，Ⅲ级33例。以同期20例女性乳腺纤维腺瘤组织标本为对照，年龄30～50岁，平均40.5岁。

1.2 主要试剂与方法 浓缩型兔抗人HIF-1α多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号BA0912）、抗Sema4D单克隆抗体（BD Biosciences公司，批号610670）、浓缩液D2-40单克隆抗体（批号ZM-0465）、DAB试剂盒及SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡标本5μm厚连续切片，常规脱蜡。采用SP免疫组化法，按照试剂盒内说明书操作。抗HIF-1α和抗Sema4D工作液均经微波修复预处理，抗原修复液为柠檬酸缓冲液（pH6.0）。D2-40单克隆抗体工作浓度为1:100。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3 HIF-1α及Sema4D表达结果判断 判断标准：以细胞核或胞浆内出现棕色颗粒为阳性信号，阳性细胞数＞20%为阳性，＜20%为阴性。

1.4 D2-40免疫组化结果判定 参照杨小敏等[4]所用方法，检测淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，计量资料以（±s） 表示，采用t检验；计数资料比较采用检验或Fisher确切概率法，相关性检验采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织HIF-1α及Sema 4D表达 HIF-1α阳性信号定位于细胞核，Sema4D阳性信号定位于细胞浆（图1，插页）。110例乳腺癌组织HIF-1α和Sema 4D阳性表达率分别为72.72%（80/110）和77.27%（85/110）；纤维腺瘤组织未见HIF-1α、Sema 4D表达，与乳腺癌组差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 D2-40表达、LVD测定及与淋巴结转移的关系

D2-40标记的微淋巴管呈棕色，壁薄无肌层，不连续，腔内无红细胞（图2，插页）。癌旁组织内淋巴管较多且多呈扩张状，癌巢内淋巴管数量较少、管腔小或闭锁状。纤维腺瘤组织中也可见微淋巴管，但数量少，管腔小。乳腺癌组织LVD显著高于纤维腺瘤组（P＜0.01），淋巴结转移组LVD显著高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1～2。

表1 乳腺癌组织与乳腺纤维腺瘤组织LVD值比较（±s）

表1 乳腺癌组织与乳腺纤维腺瘤组织LVD值比较（±s）

注：与纤维腺瘤组比较，*P＜0.01

组别乳腺癌组纤维腺瘤组n/例110 20 LVD 13.14±3.39* 8.25±2.55

表2 淋巴转移组织与未转移组织LVD值比较（±s）

表2 淋巴转移组织与未转移组织LVD值比较（±s）

注：与无淋巴转移组比较，△P＜0.01

组别淋巴转移组无淋巴转移组n/例63 47 LVD 14.47±3.29△10.26±2.82

2.3 乳腺癌组织HIF-1α与Sema 4D表达的关系在HIF-1α表达阳性的80例乳腺癌中，Sema 4D表达阳性76例；而HIF-1α表达阴性的30例乳腺癌中，Sema 4D表达阳性9例；HIF-1α与Sema 4D及表达呈正相关（r=0.691，P＜0.01）。

2.4 乳腺癌组织HIF-1α、Sema 4D表达与LVD的关系 与HIF-1α、Sema 4D表达阴性组比较，HIF-1α、Sema 4D表达阳性组有更高的LVD（P＜0.01），见表3～4。

表3 乳腺癌组织HIF-1α表达与LVD关系（±s）

表3 乳腺癌组织HIF-1α表达与LVD关系（±s）

注：与HIF-1α阴性组比较，▲P＜0.01

组别HIF-1α阳性组HIF-1α阴性组n/例80 30 LVD 13.37±3.75▲10.80±2.99

表4 乳腺癌组织Sema 4D表达与LVD关系（±s）

表4 乳腺癌组织Sema 4D表达与LVD关系（±s）

注：与Sema4D阴性组比较，▼P＜0.01

组别Sema4D阳性组Sema4D阴性组n/例85 25 LVD 13.49±3.66▼9.88±2.37

2.5 乳腺癌组织HIF-1α、Sema 4D表达与临床病理指标的关系 pTNMⅠ～Ⅱ期组、淋巴结无转移组癌组织HIF-1α、Sema 4D表达阳性率明显低于pTNMⅢ期组、有淋巴结转移组（P＜0.05，P＜0.01）；在不同年龄、组织学分级、肿块大小组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

3 讨论

缺氧是实体肿瘤生长的微环境特征之一；以适应这种微环境，同时增强肿瘤自身的侵袭性，肿瘤细率显著高于pTNMⅠ～Ⅱ期组和淋巴结阴性组。因此，推测认为：乳腺癌组织中存在淋巴管的新生，肿瘤内部LVD增加有利于乳腺癌的淋巴结转移，HIF-1α可以通过上调其下游基因Sema 4D，从而启动激活受体c-met，使其与细胞表面的PlexinB1结合来促进肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移。

表5 乳腺癌组织HIF-1α、Sema4D表达与临床病理指标的关系

总之，HIF-1α、Sema 4D表达与乳腺癌内淋巴管的增生、转移侵袭有密切关系，进一步研究这两种蛋白的相互作用机制，可能对乳腺癌的预后及提供新的有效治疗措施有一定的临床意义。胞会激活一系列相关分子信号传导途径，分泌一些重要化学介质[5]。HIF-1α是缺氧环境下被激活的重要转录因子，在许多实体瘤中高表达。HIF-1α下游有100多个靶基因，HIF-1α与靶基因上的低氧反应元件（hypoxic response element，HRE）相结合使得这些靶基因发挥各种各样的功能[6]。轴突导向因子4D（Sema 4D）可通过其表面受体Plexin B1与相应的配体c-met结合来激活受体酪氨酸激酶途径，介导肿瘤细胞迁移、侵袭和上皮细胞、内皮细胞的募集[7]，促进淋巴管生成和淋巴结转移。既往研究表明[8]，Sema 4D在乳腺癌组织高表达，它对肿瘤血管发生有重要作用。在缺乏Sema 4D的环境中，肿瘤细胞形成肿瘤包块及转移的能力被严重的削弱[9]。Sun等[10]发现，HIF-1α可以通过上调其下游基因Sema 4D的表达，从而促进恶性肿瘤细胞生长和肿瘤内部血管生成。

本研究结果显示，HIF-1α主要在癌细胞核表达，Sema 4D主要在癌细胞浆表达；它们在乳腺癌组中的表达阳性率大于纤维腺瘤组（P＜0.01）。HIF-1α表达与Sema 4D表达呈正相关（r=0.691，P＜0.01）。由此可见，在乳腺癌中，HIF-1α可能可以上调其下游基因Sema 4D表达。

本研究中LVD结果与即往研究相似[3，7]。与纤维腺瘤组相比，乳腺癌组织中LVD显著增高；HIF-1α、Sema 4D阳性表达组较阴性组有更高的LVD；pTNMⅢ期和淋巴结阳性组的HIF-1α、Sema4D表达阳性

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［5］Tang CM，Yu J.Hypoxia-inducible factor-1 as a therapeutic target in cancer［J］.J Gastroenterol Hepatol，2013，28（3）：401-405.

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Expressions of HIF-1α and Semaphorin 4D Protein in Human Breast Carcinoma and Their Relationship with Lymphatic Vessel Density and Clinical Pathological Indicators

YANG Xiaomin1,PAN dan1,CHEN Yanmei1,ZHENG Xiang1,FENG Guofei1,XU Xiaowu2. 1.Department of Pathology,the People's Hospital of Wenzhou, Wenzhou (325000),China;2.Department of Gastrointestinal Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

Objective To detect expressions of HIF-1α and semaphorin（Sema）4D in breast carcinoma and explore their correlation with lymphatic vessel density（LVD）and clinical pathological indicators.Methods The expression of HIF-1αand Sema 4D in 110 specimens of breast carcinoma were detected by immunohistochemical SP method and LVD in all specimens was measured.Different clinical pathological features were compared and breast fibroadenoma tissues were used as control group.Results The positive rates of HIF-1α and Sema 4D expression were 72.72%（80/110）and 77.27%（85/110）,respectively.HIF-1α expression were positively correlated with Sema4D expression（r=0.691,P＜0.01）.The LVD were significantly higher in breast carcinoma group than that in breast fibroadenoma group,higher in lymph node metastasis group than that in no lymph node metastasis group（P＜0.01）.The positive rates of HIF-1α and Sema 4D in pTNMⅠ-Ⅱgroup and no lymph node metastasis group were significantly lower than those in pTNMⅢ group and lymph node metastasis group（P＜0.05,P＜0.01）.No significant difference in the positive rates of HIF-1αand Sema 4D was found among different age groups,histological differentiation groups and tumor size groups（P＞0.05）.Conclusion The high expression of HIF-1α and Sema 4D in breast carcinoma may have close relationship with lymphatic hyperplasia,lymph node metastasis,and invasion.

breast neoplasms；hypoxia inducible factor-1α；semaphorin 4D；lymphatic microvessel density

2014-07-28

修回日期：2014-09-23

浙江省温州市科技计划项目（No.Y20100316）