姜黄素对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的干预作用

黄 蓉 汪 清 韦思明 潘杭丽 浙江医学高等专科学校临床医学系 杭州 310053

姜黄素对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的干预作用

黄 蓉 汪 清 韦思明 潘杭丽 浙江医学高等专科学校临床医学系 杭州 310053

目的 观察姜黄素对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响。方法 将60只成年雄性SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组和治疗组，每组20只。对照组大鼠施行左侧睾丸假手术。缺血再灌注组大鼠在左侧睾丸扭转720度2h后复位。治疗组大鼠接受与缺血再灌注组相同的外科手术，并于睾丸复位时给予姜黄素（200mg/kg）尾静脉注射。复位后4h，每组一半的大鼠行睾丸切除术，测定黄嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血红素加氧酶-1蛋白表达水平。复位后3个月，剩余大鼠行睾丸切除术，分析睾丸生精功能。结果 单侧睾丸扭转复位引起同侧睾丸黄嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血红素加氧酶-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），睾丸生精功能明显下降（P＜0.05）。姜黄素干预后，同侧睾丸黄嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平显著下降（P＜0.05），血红素加氧酶-1蛋白表达水平明显提高（P＜0.05），睾丸生精功能明显改善（P＜0.05）。结论 姜黄素通过抑制黄嘌呤氧化酶活性、提高血红素加氧酶-1蛋白表达水平，减少活性氧含量，从而保护睾丸生精功能。

大鼠；睾丸扭转复位；缺血再灌注损伤；姜黄素

图1 三组大鼠睾丸的血红素加氧酶-1的Western blot代表性结果。1L和1R表示对照组左侧（即同侧）和右侧（即对侧）睾丸；2L和2R表示缺血再灌注组同侧和对侧睾丸；3L和3R表示治疗组同侧和对侧睾丸。

图2 睾丸组织学。A（HE ×100）：对照组双侧睾丸及缺血再灌注组和治疗组的对侧睾丸均显示了正常的曲细精管直径、生精细胞层数和精子发生。B（HE ×100）：缺血再灌注组同侧睾丸显示了曲细精管萎缩、生精细胞层数减少，精子发生停止。C（HE ×50）：治疗组同侧睾丸显示多数曲细精管正常，仅少数曲细精管异常（箭头所指处）。

睾丸扭转又称精索扭转，是指精索沿其纵轴旋转，精索内血管受压阻塞，导致睾丸缺血甚至坏死。复位是治疗睾丸扭转的现有方法，可以恢复血供，避免睾丸缺血坏死。睾丸复位后即使存活，但随后出现睾丸生精功能损伤。睾丸扭转复位后的损伤是一个缺血再灌注损伤，目前缺乏相应的临床治疗。本研究建立大鼠睾丸缺血再灌注损伤模型，探讨姜黄素对睾丸缺血再灌注损伤的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 成年雄性SD大鼠60只，体质量250～300g，由上海实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 药物及试剂 姜黄素、β-肌动蛋白抗体和黄嘌呤来源于Sigma公司。丙二醛试剂盒系南京建成生物工程研究所生产。血红素加氧酶-1抗体购于Stressgen公司。

2 实验方法

2.1 大鼠睾丸缺血再灌注损伤模型建立及治疗 用随机数余数分组法将60只成年雄性SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组和治疗组，每组20只。用氯胺酮（50mg/kg）腹腔内注射麻醉后，施行以下手术。对照组：通过左侧髂腹股沟切口暴露左侧睾丸，用11/0缝线穿过睾丸白膜，放睾丸入阴囊内，关闭切口。缺血再灌注组：通过同样的切口暴露左侧睾丸，将睾丸绕精索逆时针旋转720度，在睾丸白膜与阴囊肉膜之间用11/0缝线缝合固定，保持睾丸缺血状态。2h后，拆除缝线，将睾丸绕精索顺时针旋转720度，恢复血供，睾丸仍然存活，关闭切口。治疗组：施行与缺血再灌注组一样的外科手术，但在睾丸复位时，从尾静脉注入姜黄素（200mg/kg）。复位后4h，每组取10只大鼠行双侧睾丸切除术，测定睾丸中黄嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血红素加氧酶-1蛋白表达水平。复位后3个月，每组剩余10只大鼠行双侧睾丸切除术，分析睾丸生精功能。

2.2 黄嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平测定 以黄嘌呤为底物，采用分光光度法测定睾丸组织黄嘌呤氧化酶活性。采用硫代巴比妥酸法测定睾丸组织丙二醛水平。

2.3 血红素加氧酶-1蛋白表达水平测定 采用Western blot法检测睾丸组织血红素加氧酶-1蛋白表达水平。血红素加氧酶-1与内参照β-肌动蛋白的条带密度比值代表血红素加氧酶-1蛋白表达水平。

2.4 睾丸生精功能评估 切下睾丸做成石蜡切片，苏木苏-伊红染色。显微镜下观察睾丸曲细精管，测量曲细精管直径，并行Johnsen评分。

3 结果

3.1 丙二醛水平和黄嘌呤氧化酶活性 与对照组比较，缺血再灌注组同侧睾丸（即左侧睾丸，也就是缺血再灌注睾丸）组织丙二醛水平和黄嘌呤氧化酶活性显著升高（P＜0.05）；治疗组同侧睾丸组织的上述两个指标明显低于缺血再灌注组同侧睾丸（P＜0.05）；三组对侧睾丸（即右侧睾丸）之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 三组大鼠睾丸丙二醛水平和黄嘌呤氧化酶活性比较（±s）

表1 三组大鼠睾丸丙二醛水平和黄嘌呤氧化酶活性比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与同组对侧睾丸比较，△P＜0.05；与缺血再灌注组同侧睾丸比较，▲P＜0.05

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3.2 血红素加氧酶-1蛋白表达水平 缺血再灌注组同侧睾丸血红素加氧酶-1表达水平明显高于对照组（P＜0.05）；治疗组同侧睾丸的表达水平显著高于缺血再灌注组同侧睾丸（P＜0.05）；三组对侧睾丸之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1（插页），表2。

表2 三组大鼠睾丸血红素加氧酶-1蛋白表达水平比较（±s）

表2 三组大鼠睾丸血红素加氧酶-1蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与同组对侧睾丸比较，△P＜0.05；与缺血再灌注组同侧睾丸比较，▲P＜0.05

组别对照组缺血再灌注组治疗组n/只10 10 10同侧睾丸1.16±0.25 5.28±0.41*△9.20±0.45▲△*对侧睾丸1.08±0.23 1.11±0.21 1.13±0.26

3.3 睾丸生精功能 与对照组比较，缺血再灌注组同侧睾丸的曲细精管直径和Johnsen评分明显降低（P＜0.05）；治疗组同侧睾丸的上述指标显著高于缺血再灌注组同侧睾丸（P＜0.05）；三组对侧睾丸曲细精管直径和Johnsen评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3和图2（插页）。

4 讨论

睾丸缺血时，由于钙离子内流引起细胞内钙浓度升高，导致黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶。此外，缺血时ATP降解为次黄嘌呤。再灌注时，大量氧随血液进入缺血组织，黄嘌呤氧化酶将次黄嘌呤和氧转化为超氧阴离子、过氧化氢等活性氧。活性氧半衰期短，很难直接定量。丙二醛是活性氧引起细胞膜脂质过氧化的稳定末端产物，通常作为活性氧的间接指标[1]。本研究显示，与对照组比较，缺血再灌注组缺血再灌注损伤睾丸的黄嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平明显升高（P＜0.05），这表明睾丸缺血再灌注后，黄嘌呤氧化酶活性显著升高，引起活性氧大量产生。活性氧通过氧化细胞膜脂质、蛋白和DNA等途径导致组织损伤[2]。本研究发现，缺血再灌注组同侧睾丸丙二醛水平明显升高，睾丸生精功能显著下降（P＜0.05），提示活性氧的大量产生严重损伤睾丸生精功能。

表3 三组大鼠睾丸曲细精管直径和Johnsen评分比较（±s）

表3 三组大鼠睾丸曲细精管直径和Johnsen评分比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与同组对侧睾丸比较，△P＜0.05；与缺血再灌注组同侧睾丸比较，▲P＜0.05

组别对照组缺血再灌注组治疗组n/只10 10 10曲细精管直径/μm Johnsen评分/分同侧睾丸255.06±16.25 190.82±20.36*△229.17±24.20▲△对侧睾丸251.67±13.28 253.96±13.73 254.31±15.04同侧睾丸9.28±0.49 3.64±0.89*△7.86±0.94▲△对侧睾丸9.35±0.51 9.30±0.57 9.42±0.53

姜黄素是从植物姜黄的根茎中提取的主要成份，具有抗氧化、抗炎等功效[3-4]。已有研究报道，姜黄素能降低活性氧含量，减轻心、肺、肾的缺血再灌注损伤[3]。本研究显示，姜黄素治疗显著降低缺血再灌注损伤睾丸黄嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平，提高睾丸生精功能，表明姜黄素可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性减少活性氧产生，从而保护睾丸生精功能。姜黄素已应用于临床治疗骨关节炎，取得良好效果，未发现严重的副作用[4]。因此，临床上可将姜黄素用于睾丸扭转复位后治疗。

血红素加氧酶-1能将血红素降解为铁、一氧化碳和胆绿素，后者能被胆绿素还原酶转化为胆红素。胆绿素和胆红素都拥有抗氧化的特性。研究表明，姜黄素能诱导肾上皮细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞的血红素加氧酶-1表达上调，减轻活性氧引起的损伤[5]。本研究发现，大鼠缺血再灌注损伤睾丸丙二醛水平和血红素加氧酶-1蛋白表达水平明显增高（P＜0.05），提示睾丸缺血再灌注后，活性氧的大量产生诱导血红素加氧酶-1表达上调。与缺血再灌注组同侧睾丸比较，姜黄素干预后血红素加氧酶-1蛋白表达水平显著提高，丙二醛水平降低，提高睾丸生精功能。表明姜黄素通过诱导血红素加氧酶-1表达上调，降低活性氧水平，从而保护睾丸生精功能。因此，诱导血红素加氧酶-1表达上调可能是姜黄素减轻睾丸缺血再灌注损伤重要机制之一。

单侧睾丸扭转复位是否会引起对侧睾丸损伤，目前仍有争议。有学者认为，单侧睾丸扭转复位通过免疫等机制引起对侧睾丸损伤[6]，也有学者持否定态度[7]。本研究中，单侧睾丸扭转复位引起同侧睾丸丙二醛水平、黄嘌呤氧化酶活性、血红素加氧酶-1表达水平和睾丸生精功能发生显著改变，然而对侧睾丸未见任何改变。因此，我们认为单侧睾丸扭转复位不会导致对侧睾丸损伤。

本研究结果证实，姜黄素通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，提高血红素加氧酶-1蛋白表达水平，降低活性氧含量，从而减轻睾丸缺血再灌注损伤。

［1］Bilommi R，Nawas BA，Kusmayadi DD，et al.The effects of glutathione on malondialdehyde expression and seminiferous tubule damage in experimental testicular torsion-detorsion in Wistar rats［J］.J Pediatr Urol，2013，9（6 Pt B）：1059-1063.

［2］Ozturk H，Ozturk H，Terzi EH，et al.Interleukin 10 reduces testicular damage in experimental testicular ischemia/reperfusion injury［J］.Urology，2014，83（2）：508.e1-6.

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［4］Henrotin Y，Gharbi M，Dierckxsens Y，et al.Decrease of a specific biomarker of collagen degradation in osteoarthritis，Coll2-1，by treatment with highly bioavailable curcumin during an exploratory clinical trial［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：159.

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Effect of Curcumin on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury of Rats

HUANG Rong,WANG Qing,WEISiming,PAN Hangli.Department of Clinical Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the effect of curcumin on testicular ischemia-reperfusion injury（IRI）of rats.Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,IRI group,and IRI+curcumin group of 20 rats in each group.Rats in control group underwent a sham operation on left testis.In IRI group,left testis was rotated 720°for 2h.Rats in IRI+curcumin group received the same surgical procedure as IRI group and intravenous administration of curcumin（200mg/kg）at testicular detorsion.Orchiectomy was performed on half of rats in each group at 4h after detorsion for measurement of the activity of xanthine oxidase, the level of malondialdehyde and heme oxygenase-1 protein.Orchiectomy was performed on the half of rats in each group at 3 months after detorsion to analyze testicular spermatogenesis.Results Unilateral testicular torsiondetorsion caused significant increase in xanthine oxidase activity,malondialdehyde level,and heme oxygenase-1 protein expression level,and significant decrease in testicular spermatogenesis in ipsilateral testes（all P＜0.05）.Rats treated with curcumin had significant decrease in xanthine oxidase activity and malondialdehyde level and significant increase in heme oxygenase-1 protein expression level and testicular spermatogenesis in ipsilateral testes（all P＜0.05）.Conclusion Curcumin protects testicular spermatogenesis by inhibiting xanthine oxidase activity and elevating heme oxygenase-1 protein expression level to reduce overgeneration of reactive oxygen species.

rats；testicular torsion-detorsion；ischemia-reperfusion injury；curcumin

2014-07-11

修回日期：2014-07-28

韦思明，Tel：15268133671；E-mail：wsm1971@hotmail.com