隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌PC9细胞的体外研究

许冠华雷俊华金丽莎陈 喆

1浙江中医药大学 杭州310006 2海南医学院附属医院肿瘤内科3浙江省中医院中心实验室

·论 著·

隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌PC9细胞的体外研究

许冠华1雷俊华2金丽莎1陈 喆3

1浙江中医药大学 杭州310006 2海南医学院附属医院肿瘤内科3浙江省中医院中心实验室

目的 观察隐丹参酮（CPT）联合顺铂（DDP）对非小细胞肺癌PC9细胞的抗肿瘤作用及其分子机制。方法 肺癌PC9细胞分为对照组、隐丹参酮组、顺铂组及联合用药组，MTT法检测细胞增殖凋亡，免疫印迹技术、RT-PCR检测抗凋亡分子的表达、STAT3及上游调控激酶JAK2/SRC蛋白表达水平及磷酸化水平。结果 隐丹参酮联合顺铂有明显抑制肺癌PC9细胞增殖作用（P＜0.05），联合用药组作用于肺癌PC9细胞24h后，caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达明显增高，高于对照组及单药组；联合用药组Mcl-1、Bcl-2、XIAP、survivin抗凋亡蛋白表达下调（P＜0.05或P＜0.01），STAT3磷酸化Tyr705和ser727水平下降，其上游JAK2磷酸化水平下调，SRC蛋白及磷酸化水平变化不明显。结论 隐丹参酮联合顺铂具有协同抗肺癌PC9细胞作用，其作用机制可能是通过抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表达水平，进而下调Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表达，上调caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达。

非小细胞肺癌；PC9细胞；隐丹参酮；顺铂

目前，肺癌是全世界发病率和死亡率最高的肿 瘤，5年生存率仅为10%～15%[1-2]。晚期非小细胞肺癌标准一线治疗仍为含铂两药联合方案化疗[3]，化疗对改善病情有一定效果，但同时对正常组织也存在毒性。本研究以隐丹参酮、顺铂单药及两药联合作用于肺癌PC9细胞，探讨隐丹参酮联合顺铂对人肺癌PC9细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制，为隐丹参酮治疗肿瘤寻求理论依据。

1 实验材料

1.1 药材与试剂 隐丹参酮购自成都曼思特生物科技有限公司（批号MUST-11081109）；顺铂购自德州德药有限公司（批号130303）；多克隆兔一抗Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak、Mcl-1、survivin、XIAP、P-STAT3-tyr705/ser727、jak2、P-jak2、src、P-src均购自CST公司；多克隆兔一抗STAT3、β-Actin均购自CST公司；多克隆兔/鼠二抗均购自CST公司；逆转录试剂盒/iTaq Universal SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司杭州宝成生物科技有限公司销售商。

1.2 细 胞 PC9细胞购自中国科学院细胞库。

1.3 仪 器 CO2细胞培养箱，Thermo公司；超净工作台，苏州精华设备公司；多功能全波长酶标仪，Thermo公司；蛋白印记检测系统，Bio-Rad公司；超低温冰箱，SANYO；凝胶成像系统，Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪，RD公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 PC9细胞复苏后以2×106/mL密度接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5%CO2的培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长至80%～90%时用0.1%胰酶消化并传代，选取对数生长期的PC9细胞用于实验。

2.2 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期的PC9细胞，消化计数后，按（6～9）×103个细胞/200μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的隐丹参酮、顺铂及隐丹参酮与顺铂联合应用处理，每孔设3个复孔。用MTT法分别检测药物与肿瘤细胞作用24、48、72h后的吸光度值（OD），各平行孔的OD值取平均数，将各测试孔的OD值减去本底OD值。计算肿瘤细胞的抑制率：抑制率=（1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值）×100%。

2.3 免疫印迹技术检测药物作用PC9细胞凋亡标记蛋白表达 取对数生长的PC9细胞，隐丹参酮、顺铂及联合应用处理24h后收集，加入细胞裂解液，冰上放置30min，每10min振荡1次，离心13 300r/min 15min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置-30℃贮存备用。灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1:1000），4℃孵育过夜，二抗（1: 1000），室温孵育2h，ECL显色。检测Cleaved-PARP/ caspase3/caspase9等凋亡标记蛋白酶原和剪切活化片段的表达水平，β-Actin检测作为对照，进行细胞间蛋白表达的比较。

2.4 免疫印迹技术、RT-PCR检测PC9细胞抗凋亡分子蛋白表达水平和凋亡抑制因子基因转录水平取对数生长的PC9细胞，隐丹参酮、顺铂及联合应用处理24h后收集，加入细胞裂解液，冰上放置30min，每10min振荡1次，13 300r/min离心15min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置-30℃贮存备用。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1:1000），4℃孵育过夜，二抗（1:1000），室温孵育2h，ECL显色。检测抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、survivin、XIAP和促凋亡蛋白Bak、Bax的表达，β-Actin检测作为内对照，进行细胞间蛋白表达的比较。

人非小细胞肺癌细胞系PC9接种于6孔板，2× 105个细胞/孔，培养过夜至对数生长期。隐丹参酮组、顺铂组、隐丹参酮/顺铂联合组分别作用12h，空白设为对照组，TRIZON提取RNA，逆转录完成后荧光定量PCR技术检测Bcl-2、Survivin凋亡抑制因子基因转录水平。

2.5 免疫印迹技术检测隐丹参酮联合顺铂对PC9细胞STAT3及上游调控激酶Jak2/Src蛋白表达水平及磷酸化水平 隐丹参酮单药组、顺铂单药组、隐丹参酮/顺铂联合组处理4h后，空白组设置为对照组。RIPA裂解液提取总蛋白，免疫印迹检测STAT3及其上游调控激酶Jak2/Src表达水平和磷酸化水平。

2.6 统计学方法 应用SPSS17.0软件实验数据用均数±标准差（±s）表示，采用多因素方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 对PC9细胞增殖作用的影响 隐丹参酮、顺铂及联合用药作用于PC9细胞后，MTT结果发现隐丹参酮10μM、顺铂5μg/mL具有明显的协同抗非小细胞肺癌PC9细胞效应，且随着作用时间的延长，其抑制作用增强。见图1（封二）。统计各药物作用于PC9细胞存活率，与空白组比较，各用药组24、48、72h PC9细胞存活率均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；隐丹参酮+顺铂组细胞存活率明显降低（P＜0.05）。见表1。

3.2 PC9细胞凋亡标记性蛋白表达 隐丹参酮10μM、顺铂5μg/mL及联合用药分别作用于PC9细胞24h，观察caspase 3、caspase 9及PARP剪切段蛋白的表达，β-actin作为内参。结果显示，隐丹参酮及顺铂单药组作用于 PC9细胞后 caspase 3、caspase 9及PARP剪切段蛋白表达不明显，而两药联合组caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达明显增高，见图2（封二）。

表1 各组PC9细胞24、48及72h存活率比较（±s） %

表1 各组PC9细胞24、48及72h存活率比较（±s） %

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与隐丹参酮组和顺铂组比较，△P＜0.05

组别空白对照组隐丹参酮组顺铂组隐丹参酮+顺铂组n/孔3333 24h 100 92.22±2.75* 85.19±2.4** 47.47±1.62*△48h 100 86.54±1.60* 73.99±0.98** 38.53±2.46**△72h 100 73.89±1.46** 59.14±0.89* 30.49±2.51*△

3.3 PC9细胞凋亡相关蛋白表达 隐丹参酮10μM联合顺铂5μg/mL作用于PC9细胞24h下调Mcl-1、Bcl-2、survivin、XIAP蛋白的表达，bax、bak、bcl-xl蛋白水平变化不明显。见图3（封二）。

3.4 PC9细胞抗凋亡因子mRNA表达水平 隐丹参酮组、隐丹参酮+顺铂组作用于PC9细胞12h，抗凋亡因子Bcl-2、survivinm mRNA表达水平均下调（P＜0.05或P＜0.01）。隐丹参酮+顺铂组Bcl-2、survivin下调更显著（P＜0.05）。见表2。

表2 各组PC9细胞Bcl-2、survivin比较（±s）

表2 各组PC9细胞Bcl-2、survivin比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与隐丹参酮组和顺铂组比较，△P＜0.05

组别空白对照组隐丹参酮组顺铂组隐丹参酮+顺铂组n/孔3333 Bcl-2 1 0.89±0.04* 1.22±0.03* 0.48±0.28**△survivin 1 0.82±0.01* 1.33±0.09** 0.32±0.02*△

3.5 药物作用4h PC9细胞STAT3及上游调控激酶JAK2/SRC蛋白表达水平及磷酸化水平 隐丹参酮10μM联合顺铂5μg/mL作用于PC9细胞4h，STAT3磷酸化Tyr705和ser727表达水平下降，其上游调控激酶JAK2磷酸化表达下降，SRC磷酸化表达水平变化不明显，见图4～5（封二）。

4 讨论

隐丹参酮是丹参的脂溶性成分之一，具有菲醌结构，菲醌结构中包含的菲环结构可与DNA结合，且呋喃环和醌类结构可产生自由基，引起DNA损伤，从而抑制肿瘤细胞DNA的合成[5]。

caspase家族蛋白酶在细胞凋亡信号传导中起着关键性作用。陈春雷等[6]研究提示隐丹参酮能明显抑制人胆管癌HCCC-9810细胞的增殖，其作用机制是通过下调survivin基因表达及上调caspase-3蛋白表达来诱导HCCC-9810细胞凋亡。本研究发现，顺铂和隐丹参酮均能抑制肺癌PC9细胞增殖并诱导其凋亡，但两药联合后增殖抑制作用和凋亡诱导作用显著高于单用顺铂或隐丹参酮，两药联合进一步增加了PC9细胞caspase 3和caspase 9的活化和PARP剪切段蛋白的表达，提示隐丹参酮能够通过调控caspases家族增强顺铂对肺癌PC9细胞的凋亡诱导作用。

信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）与肿瘤发生、转移侵袭、肿瘤新生血管生成、化疗抗性密切相关[7]。STAT3蛋白通过SH2结构域相互结合形成二聚体，迅速移位至核内，与特异的DNA启动子序列结合，启动相应的基因如抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-Xl、Mcl-1、Xiap和survivin、细胞周期调控基因cyclin D1和c-myc、血管生成因子VEGF、基质金属酶mmp2/9表达，促进肿瘤细胞增殖、存活、凋亡抗性、肿瘤新生血管形成及转移侵袭[8]。应用免疫印迹技术检测Bcl-2家族成员表达，提示隐丹参酮联合顺铂下调Mcl-1、Bcl-2、survivin、XIAP蛋白表达。

最新研究发现[9]，抑制STAT3酪氨酸Tyr705水平可阻断肿瘤细胞异常活化的STAT3信号通路，进而促肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成和转移侵袭，与化疗药物联合应用可发挥增效减毒的功效。

本研究结果显示，隐丹参酮联合顺铂作用于PC9细胞通过抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表达水平进而下调Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表达及Bcl-2、Survivin的基因转录水平；提示隐丹参酮联合顺铂协同抗肿瘤机制与其通过抑制STAT3磷酸化途径有关。今后将在此基础上进一步研究其抗肿瘤的深层次机制，为隐丹参酮联合顺铂开发为临床用药提供重要的实验依据。

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Effect of Cryptotanshinone Combined with Cisplatin on Non-small-cell Lung Cancer Cell PC9

XU Guan-hua1，LEI Junhua2，JIN Lisha1，CHEN Zhe3. 1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou（310006），China；2.Department of Oncology,Hospital affiliated to Hainan Medical College；3.Central Laboratory，Zhejiang Provincial Hospital of TCM.

Objective To study the effect of cryptotanshinone in combination of cisplatin on non-small-cell lung cancer（NSCLS）cell PC9 and its underlying molecular mechanism.Methods PC9 cells were divided into four groups:control,cryptotanshinone,cisplatin,and the combination of cryptotanshinone and cisplatin,the cells in each group were treated with the corresponding drugs.Apoptosis was assayed by MTT;protein markers of apoptosis and the protein expression and phosphorylation of STAT3 and JAK2/SRC were detected by immunoblotting and RTPCR.Results Cryptotanshinone combined with cisplatin significantly inhibited the proliferation of lung cancer PC9 cells（P＜0.05）.After treated with the combination of cryptotanshinone and cisplatin for 24h,the expression of cleaved caspase 3,cleaved caspase 9 and cleaved PARP in PC9 cells were significantly higher than that of control group and single drug groups;compared to other groups,the expression of protein markers of apoptostic Bcl-2,Mcl-1 and XIAP were reduced,STAT3 phosphorylation on Tyr705 and ser727 was decreased,and the upstream JAK2 phosphorylation level was lowered in the combination group（P＜0.05 or P＜0.01）,but the protein expression and phosphorylation of SRC did not differ.Conclusion Cryptotanshinone combined with cisplatin has synergistic effect on PC9 cells,which may be done by inhibiting the expression of STAT3 phosphorylation on Tyr705 and ser727, then downregulating the expression of Mcl-1,Bcl-2,XIAP and Survivin proteins and increasing the expression of cleaved caspase3,cleaved caspase 9,and cleaved PRAP.

non-small-cell lung cancer；PC9 cells；cryptotanshinone；cisplatin

2014-06-07

修回日期：2014-08-01

浙江省自然科学基金（No.LY13H290014）