HIV-1整合酶3′端加工抑制剂筛选方法的建立与优化

陆翠林，张 旋，詹金彪，杨柳萌，郑永唐

（1.中国科学院昆明动物研究所，中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室，云南昆明 650223；2.中国科学院大学，北京 100039；3.浙江大学医学院生物化学系，浙江 杭州 310058）

人类免疫缺陷病病毒1（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）感染宿主细胞是一个复杂的过程，HIV-1整合酶在其中发挥重要作用。整合酶通过3′端加工（3′-processing，3′-P）和链转移（strand transfer，ST）功能，将病毒 cDNA整合到宿主细胞基因组上［1］。HIV-1整合酶特异性识别HIV-1 cDNA长末端重复序列 （LTR）3′端CAGT碱基，并剪切GT碱基的过程称为整合酶3′端加工活性［2］，抑制整合酶3′端加工活性能有效地抑制HIV-1病毒在宿主细胞中的复制。目前用于整合酶3′端加工抑制剂筛选的方法主要有：放射自显影［3］、时间分辨荧光、荧光共振能量转移［4］等。放射自显影法存在放射性污染，时间分辨荧光则需要特殊检测仪器，这二种方法都不易普及；荧光共振能量转移在液相环境中进行，能更好地模拟体内整合酶活性，检测仪器相对简单，同时保留了荧光检测技术灵敏度高的特点。

本文采用荧光共振能量转移原理，利用文献报道［5］设计的3′端加工底物，通过考察检测波长、缓冲液配方、整合酶和底物浓度、金属离子等因素，建立并优化整合酶3′端加工活性检测方法，用阳性药物雷特格韦和杨梅黄素进行验证，采用建立的方法检测了25个细胞水平具有抗HIV-1活性但靶点不明确的化合物对整合酶3′端加工的影响，筛选到2个具有较强抑制整合酶3′端加工活性的抑制剂，为抗HIV新化合物的后续研究奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 反应底物 DS-1：5′-［FAM］-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CGTGGA AAA TCTCTA GCA GT-［DABCYL］-3′［5］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和修饰。

1.2 主要试剂和材料 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazinyl ethanesulfonic acid，HEPES）、聚乙二醇8000（polyethylene glycol 8000，PEG-8000）、氯化锰（manganese chloride，MnCl2）、氯化镁（magnesium chloride，MgCl2）为Sigma公司产品；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）为Merck公司产品；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）为Roche公司产品；三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、甘油（Glycerol）为AMRESCO产品；HCl为西陇化工股份有限公司产品；脱氧核糖核酸酶I（DNase I）为 TaKaRa产品；HIV-1整合酶（HIV-1 integrase，HIV-1 IN）购自XpressBio公司或由浙江大学詹金彪老师惠赠；雷特格韦（Raltegravir）购自Selleckchem公司；杨梅黄素（Myricetin）购自北京新宏伟博科技有限公司；96孔黑色酶标板为美国Corning产品。

1.3 反应底物的制备［6］将带标记的反应底物DS-1用灭菌水配制成浓度为100μmol·L-1的溶液，沸水浴中煮沸5 min，缓慢冷却至室温后分装，-20℃避光保存。

1.4 反应底物最适检测波长确定 用过量DNase I切割反应底物，固定激发波长为490 nm，检测不同发射波长条件下底物产生的荧光增量，以最大荧光增量条件下的波长为最适发射波长；固定发射波长为525 nm，检测不同激发波长条件下底物产生的荧光增量，以最大荧光增量条件下的波长为最适激发波长。

1．5 HIV-1整合酶3′端加工检测方法的建立 反应在96孔黑色酶标板上进行，每孔加入2×反应缓冲液50μl，依次加入灭菌水、反应底物和整合酶，使反应体系为100μl，同时设置不含整合酶的对照孔，37℃孵育。每隔1 h，检测1次荧光值。计算不同反应条件下底物荧光值的变化，底物荧光增量最大的反应条件即为检测整合酶3′端加工的较优条件。

1．6 HIV-1整合酶3′端加工抑制剂筛选 将待测化合物在96孔黑色酶标板上5倍倍比稀释，同时设置含有抑制剂的阳性药物对照与不含抑制剂的阴性对照。每孔加入2×反应缓冲液50μl，混匀后，加入整合酶，37℃孵育30 min后加入反应底物，检测荧光值。37℃反应6 h后再次检测荧光值。计算不同浓度条件下待测化合物对HIV整合酶3′端加工活性的抑制作用。计算公式为：抑制率／%＝（1-实验孔荧光增量／对照孔荧光增量）×100%。

2 结果

2.1 反应底物最适检测波长确定 当激发波长固定为490 nm，发射波长为525 nm时检测到的荧光值最高，此时本底值也相对较低（Fig 1A）；当发射波长固定为525 nm，激发波长为495 nm时荧光值最高，此时本底值接近零（Fig 1B）。综合Fig 1的结果，最后确定反应底物检测的激发波长为495 nm，发射波长为525 nm。

Fig 1 Determ ining testing wavelength of HIV-1 integrase 3′-processingA：Detection range of emission wavelength was from 500 nm to 550 nm when fixed excitation wavelength on 490 nm；B：Detection range of excitation wavelength was from 470nm to 500 nm when fixed emission wavelength on 525 nm

2.2 缓冲液确定 过量DNase I切割不同浓度的反应底物，根据切割前后荧光值的变化，确定反应底物最低使用浓度为100 nmol·L-1。固定整合酶浓度为1.6μmol·L-1，底物浓度为100 nmol·L-1，在整合酶过量的条件下检测3种不同的缓冲液［7］在不同的时间点对整合酶3′端加工活性的影响。经检测发现缓冲液 1〔80 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5），20 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MgCl2，0.2 g·L-1BSA〕和缓冲液3〔50mmol·L-1HEPES（pH 7.5），20mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MgCl2，10%PEG8000〕可促进整合酶3′端加工活性（Fig 2A、2C），这2种缓冲液条件下反应荧光值随着反应时间的进行呈增长趋势，且缓冲液1条件下反应荧光增量高于缓冲液3条件下的荧光增量，即缓冲液1效果优于缓冲液3；而缓冲液2〔50 mmol·L-1HEPES（pH 7.5），10 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MgCl2，20% 甘油〕存在条件下荧光增量反而出现负值（Fig 2B），不适于作为检测整合酶3′端加工活性的缓冲液。

Fig 2 Effects of 3 buffers on integrase 3′-processing（n＝3）A：Buffer 1；B：Buffer 2；C：Buffer 3

2.3 整合酶浓度和底物浓度的确定 整合酶以二聚体的形式发挥3′端加工作用，体外检测整合酶3′端活性加工时，整合酶与底物的浓度比在2∶1～70∶1的范围内比较合适［8］。当DS-1浓度为100 nmol·L-1时，底物的荧光值随着整合酶浓度的升高而升高，当整合酶浓度达到3.2μmol·L-1时，底物荧光增量达到峰值，继续增高整合酶的浓度，荧光增量反而降低（Fig 3A），可能是因为高浓度的整合酶会发生聚集，从而影响其活性［8］。

为了降低整合酶的使用浓度，固定整合酶浓度为1μmol·L-1，检测发现反应荧光增量与底物浓度呈线性关系，当整合酶浓度为1μmol·L-1，底物浓度为500 nmol·L-1时，整合酶3′端加工活性最强（Fig 3B）。

Fig 3 Effects of integrase and substrate on integrase 3′-processing（n＝3）A：integrase（IN）；B：substrate DS-1

2.4 金属离子的选择以及使用浓度的确定 使用缓冲液1时，整合酶3′端加工活性随着镁离子浓度的升高而升高，当镁离子浓度高于20 mmol·L-1时，整合酶的活性趋于稳定（Fig 4A）；低浓度锰离子对整合酶3′端加工活性的促进作用高于高浓度锰离子的促进作用（Fig 4B），且缓冲液1条件下，镁离子对整合酶3′端加工活性的促进作用强于锰离子。

2.5 整合酶3′端加工反应条件 根据“2.1-2.4”实验结果，较优的整合酶3′端加工反应条件汇总如Tab 1所示。

Tab 1 Reaction conditions of integrase3′-processing in vitro

2.6 整合酶3′端加工抑制剂筛选方法的验证 利用阳性药物雷特格韦［9］和杨梅黄素［5］对已经优化建立的整合酶3′端加工抑制剂筛选方法进行验证，结果显示：雷特格韦和杨梅黄素能有效地抑制整合酶3′端加工活性，其抑制的IC50分别为197.24μmol·L-1（Fig 5A）和 18.75μmol·L-1（Fig 5B）。表明优化建立的方法可适用于整合酶3′端加工抑制剂的筛选。

2.7 整合酶3′端加工抑制剂的筛选 利用优化建立的方法检测了25个细胞水平具有抗HIV-1活性但靶点不明确的化合物对整合酶3′端加工的抑制作用，共发现10个化合物具有一定抑制作用，其中化合物6、7对整合酶3′端加工抑制的IC50值为 41.55 mg·L-1（Fig 6A）、56.69 mg·L-1（Fig 6B）。它们在细胞水平抗 HIV-1活性［10-13］的治疗指数分别为6464.04、5933.85，表现出较强的抗HIV-1活性。

3 讨论

目前整合酶3′端加工抑制剂筛选的方法中，放射自显影和时间分辨荧光存在一定的局限性，不易普及，荧光共振能量转移原理方法则具有较好的优势。本研究利用荧光共振能量转移原理建立的方法，与文献［5］报道建立的方法相比有以下几点不同：（1）本研究对一定波长范围的发射波长和激发波长进行检测，最终确定检测波长为495 nm／525 nm，该条件下的荧光增量比485 nm／535 nm检测波长下的荧光增量更高，可提高检测灵敏度。（2）体内整合酶结合镁离子而发挥活性［1］，体外整合酶一般与锰离子结合后的活性强于与镁离子结合后的活性［3，5-6］，所以体外实验中一般选用锰离子作为金属辅助离子。当缓冲液成分不同时，镁离子或锰离子对整合酶3′端加工活性的影响不同［8］。我们采用3种不同的缓冲液，检测缓冲液成分对整合酶活性的影响，确定了较佳的缓冲液配方，同时检测了该缓冲液条件下这2种金属离子对整合酶3′端加工活性的影响，最终确定选用20 mmol·L-1的镁离子整合酶3′端加工活性最强。反应中使用镁离子能更好地模拟体内整合酶活性。（3）当底物浓度为100 nmol·L-1和整合酶浓度为3.2μmol·L-1条件下，整合酶3′端加工活性最强，但整合酶的复性是难题，高用量增加了检测成本。整合酶浓度为800～3200 nmol·L-1时荧光增量随着酶浓度的升高而升高，所以我们检测了酶浓度为1μmol·L-1时整合酶3′端加工活性与底物浓度的关系，发现低浓度整合酶、高浓度底物不影响检测灵敏度。最终整合酶的用量从文献［5］的 1.56μmol·L-1降至 1μmol·L-1，节约了酶用量。（4）杨梅黄素对整合酶3′端加工抑制的 IC50为18.75 μmol·L-1，检测结果与 Tramontano等［14］用 40个碱基的DNA作为整合酶3′端加工的底物时检测到的杨梅黄素的IC50值为（13±1.6）μmol·L-1接近，而与 He等［5］的结果（5.6μmol·L-1）略有差异，这可能是由于使用不同的金属离子造成的。

Fig 4 Effects ofmetal ions on integrase 3′-processing（n＝3）A：MgCl2；B：MnCl2

Fig 5 Inhibition of raltegravir and myricetin on integrase 3′-processing（n＝5）A：Raltegravir；B：Myricetin

Fig 6 Screening of HIV-1 integrase 3′-processing inhibitor（n＝3）A：inhibition of compound 6 on integrase 3′-processing；B：inhibition of compound 7 on integrase 3′-processing.

综上所述，我们成功地建立并优化了整合酶3′端加工抑制剂筛选方法，金属离子使用镁离子，能更好地模拟整合酶在体内的反应条件，有助于有效的整合酶3′端加工抑制剂的筛选。

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