脑肠肽通过抗炎抗氧化作用发挥酒精性肝损伤的保护作用

孙梦雯，胡世莲，殷 实，严 光

（安徽医科大学附属省立医院老年病科，安徽省老年病研究所，安徽合肥 230001）

我国是肝病大国，由于乙肝疫苗的普及、抗肝炎病毒药物的应用和传染病防治方法的有效实施，病毒性肝炎新发病例不断减少；与之相反，随着人民生活水平的提高，肥胖、糖尿病和酒精滥用相关肝病的发病率迅速增加，可以预计，未来10～20年酒精性或者肥胖引起的肝病，将取代病毒性肝病成为严重影响人民健康的主要病因。但这方面国家投入和研究水平仍亟待加强，特别是酒精引起的酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）长期没有得到应有的重视。

长期饮酒是全世界导致慢性肝病的重要原因，可导致肝硬化和肝癌。几乎所有的重度饮酒者发展为脂肪肝，其中只有20%～40%可发展为严重ALD包括酒精性肝炎、酒精性肝纤维化等，严重威胁人类健康。ALD缺乏有针对性的靶点治疗方法，临床上只能以对症治疗为主，因此，建立更接近人类酒精性动物模型是进而利用动物模型研究发生机制研究并筛选有效治疗ALD药物的基石［1］。目前，国际上通用的ALD动物模型有两种，大都有关ALD机制成果均来源于这些动物模型研究成果［1］。ALD动物模型一为液体酒精饲料喂饲，另一种为手术置胃管。但二者均存在严重不足，前者损伤轻微，后者费用高难度大，动物易死亡。二者的共同缺点是和人类ALD的病理改变有相当大的差距，这大大妨碍了ALD的机制研究及后续ALD治疗方法的研究。美国国立卫生研究院（NIH）酒精研究所（NIAAA）肝病研究室（Laboratory of Liver Diseases）新近建立的乙醇诱导急性小鼠酒精性肝损伤模型［2］。研究表明，氧自由基和炎症参与了酒精肝的病理过程［2］。近年发现，脑肠肽是生长激素释放促分泌素受体的一种内源性配体，因为它有促GH释放功能，所以被命名为脑肠肽。最近研究表明，脑肠肽对非酒精脂肪肝具有保护作用［3］，亦有研究表明，脑肠肽具有抗炎作用［4］，基于以上研究基础，我们在引进最新酒精性动物模型的基础上，研究了脑肠肽对酒精性肝损伤小鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 脑肠肽系美国Sigma公司产品，脑肠肽临用前先用无菌生理盐水稀释。Lieber-DeCarli酒精液体饲料（标准型，酒精热量36%），产品号：TP-4030，购自南通特洛菲饲料科技有限公司。酒精为工业纯级别（99.9%）。丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20021129；天冬门氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20021129；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20021219；GSH-px测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20021207。

1.2 动物模型的建立 根据文献模型稍有改进［5］。C57／B6小鼠，8～10周龄，体质量（30±2）g，购于安徽医科大学实验动物中心。给予含5%乙醇的液体饲料，自由喂养4周，最后1次按5 g·kg-1的剂量给予酒精灌胃1次，9 h后自小鼠后眼眶静脉丛采血，分离血清，4℃保存待测转氨酶活性。颈椎脱臼法处死动物，立即摘取肝脏标本，部分甲醛固定留待病理检查，取部分肝组织-70℃保存待测。

1.3 动物分组及处理 设正常对照组、模型组、脑肠肽给药组（5、10、20μg·kg-1）。将动物按体重分层随机分组，每组6只。正常对照组等量生理盐水腹腔注射（ip）；预防用药方案：从造模d 1起，按上述剂量给予脑肠肽腹腔注射，每天1次。

1.4 检测指标及方法 ALT、AST、MDA、GSH-Px、SOD测定按试剂盒说明书进行。

1．5 小鼠肝脏H＆E染色 采用常规病理方法。简言之，10%的中性甲醛固定，制备石蜡包块，切片，HE染色，显微镜下观察肝脏病理改变。

1．6 肝脏中RNA的抽提及相关基因表达水平的定量RT-PCR（real-time PCR）检测 肝脏中RNA采用 RNeasy Mini Kit（Qiagen Inc，Stanford Santa Clarita，CA，USA）方法抽提，按试剂盒说明书进行，测定RNA纯度和浓度。随后进行 反转录反应：1 μg RNA用反转录试剂盒（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.Applied Biosystems，Bedford，MA，USA）反转录成cDNA。最后使用定量PCR反应体系：使用iTaq SYBR Green Supermix（iTaq SYBR Green Supermix With ROX BIO-RAD.Hercules，CA，USA）加入10μmol·L-1primers，2μl of cDNA。定量PCR反应使用仪器为7500 Fast Real-Time PCR System.（AB Applied Biosystems，Carlsbad，California，USA），反应条件为：95℃ 3 min，40 cycles of 95℃ （25 s），58℃ （25 min），and 72℃ （1 min）。每个样本做3个复孔。使用引物序列见Tab 1。

1.7 统计学处理 结果数据以表示，组间差异用ANOVA法进行分析比较，显著性差异P值设定为0.05。

2 结果

2.1 脑肠肽对酒精性肝损伤小鼠转氨酶的影响在序贯给予酒精饲料4周后，模型组血清ALT、AST活性升高，而在序贯期间预防给药，分别给予ip脑肠肽（5、10、20μg·kg-1）均能降低血清中升高的ALT、AST活性，在脑肠肽的3个剂量中以20μg·kg-1为最明显（Fig 1）。

Tab 1 Primer sequence

Fig 1 Ghrelin alleviates ethanol-induced liver injuryA：Serum transaminase ALT；B：AST levels；*P＜0.05，**P＜0.01 denotes significant difference from corresponding ethanol-fed model groups.ALT：alanine transaminase；AST：aspartate aminotransferace.

2.2 脑肠肽对酒精性肝损伤小鼠肝脏病理的影响HE染色发现，模型组肝内出现弥漫性脂肪病变，以3区为主，肝血窦充血明显，可见少许炎细胞浸润。脑肠肽处理可减轻炎症细胞浸润，但对脂肪病变影响不明显（Fig 2）。

Fig 2 Ghrelin im proves ethanol-induced liver pathologic change

2.3 脑肠肽对酒精性肝损伤小鼠自由基的影响模型组肝匀浆MDA水平升高，GSH-Px和SOD活性降低。预防给予 ip脑肠肽（5、10、20μg·kg-1）均能降低肝匀浆中升高MDA的水平，并能提高肝匀浆GSH-Px和SOD活性（Tab 2）。

Tab 2 Effects of ghrelin adm inistration on hepatic MDA levels，SOD and GSH-Px activities in alcohol fatty liver

2.4 脑肠肽对酒精性肝损伤小鼠炎症细胞因子的影响 与正常组相比，模型组肝脏炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和 MCP-1明显升高。预防给予 ip脑肠肽（5、10、20μg·kg-1）均能降低上述炎性细胞因子的mRNA表达（Fig 3）。

3 讨论

酒精性肝损伤动物模型的建立一直以来是酒精研究领域的难点，以往应用最为广泛的酒精性肝损害的模型是应用含酒精的Lieber-DeCarli液体饮食喂养小鼠4～6周，但是这种模型仅仅只能诱发轻度脂肪变性，轻度的血清ALT升高，极少量甚至无炎症。因此，建立一种具有明显肝细胞损害和纤维化的重度酒精肝模型至关重要。最近NIAAA建立了一种慢性酒精喂养加酒精灌胃的小鼠模型（NIAAA模型，国内亦称高氏Gao-Binge模型）。这种模型模仿多数酒精性肝炎患者的饮酒方式，即这些患者有多年慢性饮酒的背景，以及近期醉酒的病史。在小鼠身上即可协同作用导致小鼠的脂肪变性、肝脏损伤和炎症［1，5］。目前，全世界许多实验室已经应用这种经过修正的慢性酒精喂养加酒精灌胃的小鼠和大鼠模型。NIAAA建立的慢性酒精喂养加急性酒精灌胃的模型，除了容易操作外，还具有费用低和时间短的优点。用含酒精的Lieber-DeCarli饮食喂养小鼠10 d或者延长至4～8周，然后用单剂酒精灌胃（5 g·kg-1）1次，会导致血清ALT和AST明显升高，灌胃后9 h在C57BL／6小鼠达到峰值，远远高于单独慢性酒精喂养的小鼠。这种模型还也可以改进为慢性酒精喂养更长时间加多次酒精灌胃［1，5］。

Fig 3 Ghrelin attenuates alcohol-induced proinflammatory cytokine and chemokinemRNA expression in the liver*P＜0.05，**P＜0.01 denotes significantdifference from corresponding ethanol-fedmodel groups.TNF：tumor necrosis factor；IL：interferon；MCP-1：monocyte chemoattractant protein 1.

ALD主要是乙醇及其衍生物的代谢过程中直接或间接诱导的炎症反应、氧化应激、肠源性内毒素（LPS）、炎性介质和营养失衡（尤其是蛋白质一热量营养不良）等多种因素相互作用的结果。酒精通过氧化应激促使反应性氧化物增加，而诱发肝脏脂肪聚集。在氧化应激相关的脂质过氧化，同时LPS在ALD时水平升高，可促进肝脏炎性细胞因子增加，氧自由基和炎性细胞因子的双重作用下可导致肝细胞凋亡、坏死，造成炎症、坏死甚至纤维化［2，6］。因此抗氧化抗炎治疗有望对抗ALD疾病的病理进展［7］。本研究发现，脑肠肽可明显降低增高的血清转氨酶活性，同时还发现脑肠肽具有抗氧化作用，其依据为脑肠肽可明显降低ALD小鼠肝匀浆中升高的MDA水平，同时提高肝匀浆SOD和GSH-Px活性，提示脑肠肽对酒精性肝损伤的保护作用与抗脂质过氧化和提高机体的抗氧化酶活性有关。最新的研究表明，脑肠肽在高脂肪引起的脂肪肝大鼠模型中具有抗自由基作用［8］；体外实验也表明，脑肠肽具有抗氧化作用［9］。本研究亦证实脑肠肽在酒精肝模型亦可降低肝损伤时脂质过氧化物的生成，同时可提高抗氧化酶活性。因此，脑肠肽在酒精性肝损伤动物模型中亦可发挥其抗氧化作用。虽然有人体实验表明给予褪黑素可以提高体内脑肠肽水平，进而减轻脂肪性肝炎程度［10］，但脑肠肽对人类ALD是否同样的抗氧化作用，仍需要在临床试验中进一步研究加以证实。

大量研究表明，天然免疫反应参与了ALD的病理生理过程［11］，其中内毒素介导性细胞因子释放引起的免疫反应在ALD发病机制中发挥重要作用［1，6，12］，本研究发现，脑肠肽可明显降低肝脏内炎症细胞因子的表达，这可能是脑肠肽保护酒精肝的重要机制之一。在过去的10年中对脑肠肽的抗炎作用颇有研究，脑肠肽不仅在休克的过程中发挥抑制炎症的作用，而且体内外的研究均表明脑肠肽具有明显的抗炎作用，可能成为炎症性疾病和损伤的潜在治疗药物。此外，脑肠肽还可以在骨髓和胸腺中促进淋巴细胞分化，延缓衰老相关的胸腺萎缩［4，13］。动物实验也表明脑肠肽具有抗炎作用，可降低大鼠脊髓损伤后中性粒细胞浸润和DNA损伤［14］。而最新研究表明脑肠肽还具有心脏保护作用，其保护作用亦与其抗炎作用有关［15］。本研究首次在酒精性肝损伤动物模型上发现脑肠肽的抗炎作用，脑肠肽可抑制酒精引起的肝脏炎症细胞因子的表达。而脑肠肽通过何种机制抑制炎性细胞因子的表达值得进一步研究。

综上所述，本研究发现，脑肠肽对小鼠酒精性肝损伤具保护作用，其机制与其抗氧化抗炎作用有关。

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