利用斑马鱼成鱼建立致幻类化合物行为评价模型

颜 慧，苏瑞斌，宫泽辉

（军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850）

斑马鱼是一种小型亚热带淡水鱼，因体侧有银蓝色的纵向条纹而得名。斑马鱼具有近似人类的各种器官系统，如心血管系统、消化系统、神经系统，与人类的基因组保守性很高，人类的很多基因已经在斑马鱼中克隆得到，而且具有相似的功能，斑马鱼作为一种新型的模式生物已广泛用于研究脊椎动物的胚胎发育，近年来随着研究的深入，斑马鱼在疾病研究、药物筛选及毒性试验中的作用也逐渐引起关注［1-3］。

药物滥用一直是世界性难题，而致幻剂在公共场所滥用现象近些年日趋严重。致幻剂是一类能引起意识改变，产生错觉和幻觉、情感改变等类似急性精神病并导致严重的行为

紊乱的精神活性物质，致幻剂引发的神经精神障碍及机制至今尚未得到完全确证，有些作用机制明显不同的化合物均能引起摄入者的幻觉。而成年斑马鱼对于环境变化与化合物干扰极为敏感，会产生相应的复杂行为变化，近几年本实验室针对斑马鱼的复杂行为表现建立了多种行为评测方法［4-5］，本文选择甲基苯丙胺及氯胺酮作为致幻化合物，利用斑马鱼多个行为表现对其致幻性进行了评价。

1 材料与方法

1.1 动物 成年3～6个月斑马鱼，AB品系，♀♂比约为1∶1，在本实验室利用斑马鱼独立养殖单元进行培养，每6～8条置于3 L水箱中。鱼水由纯净水添加海盐配制而成。室温与水温控制在（28±2）℃，光照自动控制（光照时间8∶00～18∶00），正常喂食，每天两次。所有的受试鱼均为首次实验，且不重复使用，在受试前24 h禁食。

1.2 化合物 甲基苯丙胺（methamphetamine，METH），军事医学科学院杨征教授惠赠，以鱼水配制成10 g·L-1储备液；盐酸氯胺酮（ketamine），购自 Sigma公司，CAS号：1867-66-9，以鱼水配制成100 g·L-1储备液。

1.3 仪器 斑马鱼独立养殖单元ESEN-AW-SS-1（北京爱生科技发展有限公司）；斑马鱼游泳行为视频跟踪分析系统Zebralab 3.0、成鱼行为观测箱ZebraCube（法国Viewpoint公司）。

1.4 动物分组与药物处理 斑马鱼分为4组：正常组（斑马鱼在1 L鱼水中暴露30 min后，进入含干净鱼水的测试箱中检测）；甲基苯丙胺组（处理方式同正常组，鱼在同体积2 mg·L-1甲基苯丙胺的水体中暴露30 min）；氯胺酮组（处理方式同正常组，鱼在同体积20 mg·L-1氯胺酮的水体中暴露30 min）。在栖底性及镜像反射试验中每组鱼为10～12条，社会交互试验中每组鱼为10～12对。

1.5 行为测试方法

1.5.1 栖底性试验 测试方法参考文献［6］并略加改进，行为测试装置为1.5 L梯型鱼箱（15.2 cm高×7.1 cm宽×27.9 cm顶面长×22.5 cm底面长），行为测试时，鱼箱最大程度地装满水，光照强度与之前的培养条件相同，每条鱼放于测试箱中，其游泳行为用侧面的红外高清摄像头（30 Frames／Sec，分辨率640×480）实时记录，并将视频以 AVI格式保存。利用Zebralab 3.3分析软件，将观察箱垂直方向分为上下两个分区，分析得到运动轨迹及各项运动指标。

1.5.2 镜像反射试验 行为测试装置为长方型鱼箱（10 cm高×10 cm宽×25 cm长），鱼箱的四壁由镜子制成，将距四壁1 cm的区域划定为镜像区，鱼进入该区域会看到自己的镜像，同时设定中央区，分别统计进入各区的次数、停留时间，此外根据鱼接近镜像的活动性，判定其对镜像是否具有攻击性。

1.5.3 社会交互行为试验 行为测试装置与栖底性试验中一致，不同的是每个测试箱中放入两条鱼，鱼之间的距离，为斑马鱼的社会交互行为最直接的表现方式。设定阈值来判定两条鱼是否接近，并统计接近的次数及持续时间。

1.6 统计学分析 利用GraphPad Prism 5软件绘制曲线与统计学检验，实验数据采用表示。组间比较采用oneway ANOVA进行分析，Newman-Keuls test进行组间后检验。

2 结果

2.1 致幻类化合物对斑马鱼栖底行为的影响 Fig 1显示不同处理条件下斑马鱼在观察箱中6 min内的垂直方向的运动轨迹，红色轨迹线提示高活动性，绿色表示正常运动。正常情况下斑马鱼进入新环境后，会有短暂栖底，之后多数会沿测试箱边界表现明显的探索兴趣，从运动轨迹上可见正常组斑马鱼上下穿梭较频繁，鱼在箱壁附近活动较多。甲基苯丙胺处理组中，使鱼的运动集中于底部，且在测试过程中长时间静止不动。氯胺酮短时暴露使鱼的穿梭活动明显减少。

Fig 1 Com puterized video tracks of zebrafish behavior in the tank in first 6 m in after exposed to different experimental challengesA：Normal；B：METH 2 mg·L-1；C：Ketamine 20 mg·L-1

药物处理斑马鱼后的行为指标变化与运动轨迹图一致。如Fig 2所示，与正常组相比，6 min内甲基苯丙胺预处理组的运动路程无明显变化，在上部的停留时间减少92%，垂直穿越次数下降76%（P＜0.01），氯胺酮处理组与正常组相比，运动路程无变化，垂直穿越次数下降76%（P＜0.01），而与甲基苯丙胺处理不同的是，其上部停留时间与正常组相比虽有下降趋势，但差异无显著性。

2.2 致幻类化合物对斑马鱼镜像反射行为的影响 从Fig 3可见，正常的斑马鱼表现出对镜像非常明显的兴趣，在观察的时间内基本停留在镜像区，而给用METH后，斑马鱼的轨迹发生明显变化，运动轨迹向中央区域集中，氯胺酮处理后的斑马鱼，其轨迹呈现出往复绕圈的刻板现象。

统计数据显示，与正常组相比，甲基苯丙胺与氯胺酮急性暴露30 min后，斑马鱼在中央区的停留时间比例有了明显提高（P＜0.01），相应的，在镜像区停留时间比例分别下降35%及40%（P＜0.05），此外，甲基苯丙胺处理后，斑马鱼整体的高活动性比例上升（P＜0.05），而氯胺酮处理组，斑马鱼整体的高活动性比例与正常组相比无变化，但在镜像区其高活动性运动比例提高280%，表明该化合物短时暴露可使斑马鱼对镜像产生一定的攻击性（Fig 4）。

2.3 致幻类化合物对斑马鱼社会交互行为的影响 斑马鱼的天性为群集性，正常斑马鱼每两条鱼一组放入测试箱中后，根据鱼之间的接近程度，设定3 cm为两鱼接近的阈值，在这一标准下，正常鱼表现明显的彼此接近。

Fig 2 Behavioral effects of zebrafish over 6m inZebrafish models are exposed to differentexperimental challenges for 30min in a pre-treatment beaker before being transferred into the tank for behavioral observatio**P＜0.01 vs the normal group.

给予不同药物预处理后，分别统计接近时间与接近次数，结果如Fig 5所示，与正常组相比，甲基苯丙胺急性处理后，斑马鱼之间接近次数无变化，但鱼之间的接近时间明显降低（P＜0.05），而氯胺酮则使斑马鱼之间接近次数与接近时间均有明显下降（P＜0.01，P＜0.05），提示这两种化合物可以影响斑马鱼的群集性，抑制鱼的社会交互行为，但作用机制不同。

3 讨论

本文所选用的建模化合物氯胺酮和甲基苯丙胺均属于新型毒品的范畴，其滥用近些年呈现快速的增长。尽管两者均可使人产生幻觉，但其作用机制不同。氯胺酮属于NMDA受体拮抗剂，是临床常用的一种麻醉药，氯胺酮产生滥用的基础为“分离性幻觉”，致幻作用是导致滥用的基本因素。其作用机制主要抑制丘脑，可选择性阻断痛觉冲动的传导，同时又能兴奋脑干及边缘系统，产生意识模糊、短时记忆缺失、痛觉完全消失，产生意识和感觉分离状态。而甲基苯丙胺属于中枢神经系统兴奋剂，主要是促进多巴胺神经末梢多巴胺的释放并抑制其再摄取，并与多巴胺转运体相结合，抑制多巴胺的再摄取，而使细胞间隙多巴胺浓度升高，表现为欣快感、幻觉并提高警觉性［7］。

在非人类的动物模型模拟幻觉、语言混乱与思维紊乱等外在症状难以实现，因此，为了建立具有代表性的致幻作用评价动物模型，必须表现更特异性地与致幻性相联系的其他特征。致幻剂引发的症状很多与精神障碍相类似，目前公认的其典型的临床表现，包括梦幻觉、错觉、易激惹行为及交流障碍等，实验所采用的栖底、镜像及社会交互3个行为模式来建立其筛选模型，即是基于力求模拟致幻剂的上述临床表现来设计的。

斑马鱼作为精神神经药理研究的建模动物，在给予不同刺激条件下，其复杂的行为模式与精神神经障碍行为均能良好体现。本实验室前期研究发现，在梯形测试箱中，斑马鱼垂直方向的运动轨迹可用于栖底行为的评测，以运动距离、不同区域停留时间、上下穿越次数等参数，作为模型的评价指标，可用于焦虑与恐惧、药物依赖与戒断等精神行为反应的测试［4-5］。

镜像测试是研究致幻性非常关键及特征性模型，正常的鱼接近镜子会看到自已的镜像，即为同类，它会表现出对同类的亲近，因此一直停留在镜子的附近（即镜像区），而致幻性化合物会使鱼对自己的镜像产生错觉，认为是敌人或哺食者，进而会产生攻击与逃避，在轨迹上表现出在中央区的停留明显增加［8-9］。此外斑马鱼属于群集性动物，正常情况下同种生物会成群游动与追逐［10-11］，根据这一特性而建立的社会交互测试作为评测交流障碍的一个手段，一旦鱼的彼此接近时间及次数发生变化，表明其先天的群集性受到影响。

本实验中所用甲基苯丙胺的浓度选择参考之前在斑马鱼行为测试中的预试结果，其标准是使动物产生明显行为变化，但不引起死亡。氯胺酮急性暴露的浓度是根据预试结果确定的亚麻醉浓度。实验中两种化合物急性处理组在3个模型中均表现出与正常组的明显差异，与正常组相比，其在栖底试验中表现为上下穿越次数明显降低，表明其探索兴趣受到抑制；在镜像反射测试中在镜像区停留时间明显减少，高活动性比例明显上升，提示对镜像的偏爱消失，并对镜像产生了一定的攻击性；而社会交互试验中，药物处理后两条鱼之间的接近时间明显下降，提示鱼先天的群集性发生改变。

Fig 3 Computerized video tracks of zebrafish behavior in them irror box in first 6 m in after exposed to different experimental challenges A：Normal；B：METH 2 mg·L-1；C：Ketamine 20 mg·L-1.

Fig 4 Behavioral responses tom irror image of zebrafish over 6m in after pre-exposed to different experimental challenges for 30m in*P＜0．05，**P＜0．01 vs the normal group.

Fig 5 Effects of pre-treatment w ith drugs on social behaviors of zebrafish*P＜0．05，**P＜0．01 vs the normal group.

上述结果表明，不同致幻类化合物均使斑马鱼的3种行为模式发生特征性的变化，这些变化可以作为化合物致幻性行为的考察指标。而由于甲基苯丙胺与氯胺酮的作用机制不同，因此在模型中也体现出化合物作用的个性变化，在我们在随后的测试中发现，氯胺酮在栖底测试中其最明显的特征是刻板转圈及上下穿越次数明显下降，而对于栖底性则体现出了随着浓度升高鱼在上部运动趋势愈加明显的特征；而甲基苯丙胺则体现出随着浓度升高栖底明显增加的趋势。社会交互测试中，氯胺酮处理组除了使鱼之间的接近时间明显下降，更使得两条鱼接触次数明显减少，鱼之间几乎不存在任何互动。所有这些行为指标的差异更加证实斑马鱼行为模型的特异性与可靠性，也与在啮齿类模型上的一些行为测试结果相互验证［12-13］。

综上所述，通过考察斑马鱼栖底性、镜像反射及社会交互3个行为表现，我们可以对致幻性化合物对于运动活动性、认知功能、情感意识等方面的影响进行快速评价，与大小鼠模型相比，斑马鱼对神经系统类药物反应的灵敏度较高，而多个指标对于斑马鱼的复杂行为模式进行评价可提供更多的信息，能较全面地反映药物对动物行为的影响，另外，由于斑马鱼给药方式简单，需药量少，模型建立成本低等优点，相信其行为模型会在神经精神药理学研究具有广泛的应用前景。

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