原发性高血压患者中抗α1肾上腺素受体自身抗体激活大鼠主动脉平滑肌细胞内NF-κB*

孙艳香， 袁 勇， 冯 力， 廖玉华， 朱 峰

(1中山大学附属中山医院心血管内科，广东中山 528400;

2华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科，湖北武汉 430022)

·短篇论著·

原发性高血压患者中抗α1肾上腺素受体自身抗体激活大鼠主动脉平滑肌细胞内NF-κB*

孙艳香1△， 袁 勇1， 冯 力1， 廖玉华2， 朱 峰2

(1中山大学附属中山医院心血管内科，广东中山 528400;

2华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科，湖北武汉 430022)

目的：探讨高血压患者血清中抗α1肾上腺素受体自身抗体(autoantibodies against α1-adrenergic receptor，α1-AAs)拟去甲肾上腺素的激动样效应及胞内信号分子活化机制。方法：培养大鼠主动脉平滑肌细胞。将收集的原发性高血压病人血清进行免疫亲和层析法纯化，ELISA检测其滴度后以1∶80刺激细胞，并设立不同的处理组。将α1-AAs刺激大鼠主动脉平滑肌细胞后，经Western blotting及免疫荧光方法分析胞内核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号分子激活及表达状况。结果：Western bltting显示α1-AAs刺激组中胞内核因子NF-κB (p50)表达较空白对照组明显增强，且可被α1受体阻滞剂哌唑嗪和NF-κB拮抗剂PDTC明显抑制(P＜0.05)。免疫荧光实验中，α1-AAs组荧光强度显著高于空白对照组和α1-AAs+哌唑嗪组(P＜0.01)。结论：高血压患者血清中α1-AAs能够致大鼠主动脉平滑肌细胞NF-κB活化。

高血压;α1肾上腺素受体;自身抗体;NF-κB

α1肾上腺素受体(α1-adrenergic receptor)在人体许多生理调控过程中起到重要的作用，尤其是在心血管活动中，其中包括对平滑肌收缩、心肌变时和变力以及血压的调节［1］。同时，已有报道在原发性高血压、恶性高血压及难治性高血压患者血清中发现抗 α1肾上腺素受体自身抗体(autoantibodiesagainst α1-adrenergic receptor，α1-AAs)的存在［2-3］。实验验证该自身抗体可导致动物心肌细胞肥厚和细胞间质的增加［4］，且后来的临床统计也发现高血压患者中 α1-AAs参与了高血压患者左心室重构［5］。而众多研究并未阐明α1-AAs介导的胞内分子机制，因此本研究主要探讨该自身抗体对血管平滑肌细胞内信号分子及炎症因子NF-κB的激活情况。

材料和方法

1 病例及试剂

参照2010年中国高血压防治指南高血压诊断标准。血标本抗凝后离心取上清，选取经检测后α1-AAs阳性的原发性高血压患者(24例)血清。培养基DMEM及新生牛血清购自 Gibco;BSA、CNBr-Sepharose、HRP-IgG及NC膜购自武汉凌飞公司;抗NF-κB(p50)抗体及 β-actin均购自 Cell Signaling;哌唑嗪 (prasozin，PN)和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)购自Sigma。

2 α1-AAs的检测及纯化

用ELISA［6］检测自身抗体滴度，即:多肽合成仪人工合成人α1肾上腺素受体胞外第2肽段(192～218 aa)［6］，将合成的α1肾上腺素受体抗原肽包被96孔酶联板，纯化后的α1-AAs为I抗并以不同稀释倍数(1∶40、1∶80和1∶160)稀释，IgG-HRP为酶标II抗，TMB/H2O2显色，于450 nm波长测定吸光度(A)。实验中设立空白对照和阴性对照，测A值时以空白对照调零。抗体定性判断以P/N≥2.1为阳性［P/N=(标本血清组A值-空白对照A值)/(阴性对照组A值-空白对照A值)］。以亲和层析法纯化血清中的自身抗体，具体步骤可参考本课题组以前的相关文献资料［7］。

3 细胞培养及免疫印迹检测

Wistar雄性大鼠经颈总动脉放血后，在无菌条件下迅速取出胸主动脉行组织块法培养;原代细胞经α2-actin鉴定呈阳性染色。细胞在无血清培养基中培养24 h后用α1-AAs 1∶80滴度进行刺激并分组，后提取蛋白，并按BCA法测定各样本蛋白浓度。将样品加入上样缓冲液煮沸10 min后上样。以200 V、10%的SDS-PAGE分离胶电泳40 min，100 V转膜45 min。用5%脱脂奶粉封闭1 h后洗膜15 min×3，加I抗4℃孵育过夜。再洗膜15 min×3，II抗室温孵育1 h。洗膜15 min×3后ECL发光。

4 免疫荧光实验

细胞爬片后在无血清培养基中培养24 h后分3组进行刺激，分别为空白对照组、α1-AAs刺激组及先PN抑制后加用α1-AAs刺激组。取出细胞爬片后用PBS洗细胞2次并吸干，用丙酮在冰上固定10～15 min，然后用0.1%Triton X-100透化固定细胞1 min，PBS洗3次;以1∶100加入抗NF-κB(p50)I抗(用5%BSA/PBS稀释)室温孵育2 h，再用PBS洗细胞3次加入荧光标记的II抗(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，在荧光显微镜下照相。

5 统计学处理

用SPSS 10.0软件分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，各组间比较采用ANOVA分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 血管平滑肌细胞鉴定结果

显微镜下可见细胞呈典型的“峰-谷”样生长，免疫细胞化学染色显示细胞内 α2-actin呈阳性，见图1。

Figure 1.The identification of rat VSMCs by immunocytochemistry(×400).图1 大鼠血管平滑肌细胞的鉴定

2 α1-AAs刺激平滑肌细胞内信号分子NF-κB的激活及核转移

不同处理组细胞的裂解蛋白经Western blotting，结合图形灰度分析可看出:α1-AAs刺激组NF-κB较α1-AAs+PN、α1-AAs+PDTC及空白对照组表达明显增高(P＜0.05)，而稍弱于去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)组(P＞0.05)，见图2。这表明在α1-AAs可导致胞内分子NF-κB的激活，并被α1受体拮抗剂PN和NF-κB特异性阻滞剂PDTC所抑制。

进一步用抗NF-κB抗体通过细胞免疫荧光检测其在不同处理组间细胞核内分子的表达情况:对照组细胞中NF-κB主要存在于胞浆及很少一部分位于胞核周边;α1-AAs刺激30 min后，NF-κB表达逐渐趋于核周间隙，核内表达明显高于空白对照组(P＜0.01);而先用α1受体拮抗剂PN作用后再加α1-AAs刺激则核内NF-κB分子表达量显著下降(P＜0.01)，见图3。上述结果表明α1-AAs能促进胞内NF-κB p50向细胞核内转移，且被α1受体拮抗剂所拮抗。

Figure 2.The activation of NF-κB(p50)in response to α1-AAs.PN:prazosin(1 μmol/L);PDTC:pyrrolidine dithiocarbamate(0.1 mmol/L);NE:norepinephrine (100 μmol/L).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control，α1-AAs+PN and α1-AAs+PDTC.图2 NF-κB分子在平滑肌细胞内的激活情况

Figure 3.The expression of NF-κB(p50)in VSMCs in different groups detected by immunofluorescence(×400).MFI:mean fluorescence intensity.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs α1-AAs.图3 免疫荧光细胞染色显示NF-κB(p50)在胞核内的表达

讨论

近年来，免疫因素在高血压的发病中起到越来越重要的作用，其中自身抗体在高血压患者中的研究较多。Fu等［2］首先在恶性高血压患者血清中发现α1-AAs的存在;后在原发性高血压患者血清中也检测到该抗体［3］。α1受体属G蛋白偶联受体超家族，在机体心血管的调节中起着十分重要的作用。α1-AAs具有类似去甲肾上腺素样激动性作用，可能参与高血压的发生发展及其所致靶器官的损害，且由于该抗体在恶性高血压及难治性高血压病人血清中的检出率可达到25.3%［8］，所以阐明该抗体作用于血管平滑肌细胞胞内信号分子机制的激活情况很有必要。

NF-κB分子是大多数炎症因子及活性物质发挥生物作用的通路，由p50和p65两个亚基组成，静止状态下与抑制性蛋白IκB结合，当细胞在受某些刺激后则与 IκB分离而转入胞核从而调控基因表达［9-10］。NF-κB信号转导通路常见且已有研究报道该分子参与多种细胞增殖及抗凋亡的调控［11］。活化的NF-κB可单独或与其它转录因子协同，对众多基因尤其是涉及炎症和免疫反应等方面的基因表达起着关键性的调控作用［12］，从而诱导许多因子的转录。

本实验结果显示α1-AAs刺激大鼠主动脉平滑肌细胞后可致胞内NF-κB分子活化且向核内转移及表达量增加，显著高于哌唑嗪或PDTC拮抗组及空白对照组，而稍低于去甲肾上腺素刺激组，表明NF-κB信号分子途径的激活参与了α1-AAs所致的激动样效应，从而可能介导平滑肌细胞增殖、血管炎性反应及心血管重构等。但从结果中也可看到，NF-κB特异性受体拮抗剂PDTC和α1受体拮抗剂哌唑嗪并不能完全抑制该自身抗体刺激后细胞内NF-κB分子的表达，从而可以推测NF-κB分子的激活可能只是该激动性自身抗体作用于自身受体后介导的胞内活化信号分子通路之一。

至于α1-AAs的产生机制，推测该抗体可能产生于高血压引起血管损伤后的免疫反应，由于血管损伤，内源性抗原暴露，使α1受体的抗原性发生改变，激活自身反应性T细胞，从而产生自身抗体;我们课题组也报道其产生与其受体基因多态性相关，可能是环境与遗传因素共同作用的结果［13-14］。

总之，本实验显示原发性高血压患者血清中激动性α1-AAs可能通过激活血管平滑肌细胞内NF-κB分子而调节下游信号分子的表达，结合前述的其它信号途径如该自身抗体与受体结合后促使AP-1激活并诱导原癌基因c-jun和c-fos表达［6］，从而一起介导细胞增殖和血管炎症反应的发生。对该信号机制的研究进一步在分子水平上奠定了免疫机制在高血压病中的作用，并为α1-AAs所致的类似NE激动样效应提供了理论依据;同时我们可以通过对NF-κB通路的调节为临床抗血管炎症及其所致的血管重塑、靶器官重构提供新的治疗思路。

［1］宋 峣，张幼怡.肾上腺素受体与血管紧张素受体间的交互作用［J］.中国病理生理杂志，1995，15(9): 851-854.

［2］Fu ML，Herlitz H，Wallukat G，et al.Functional autoimmune epitope α1-adrenergic receptors in patients with malignant hypertension［J］.Lancet，1994，344(8938): 1660-1663.

［3］Luther HP，Homuth V，Wallukat G.α1-Adrenergic receptor antibodies in patients with primary hypertension［J］.Hypertension，1997，29(2):678-682.

［4］周子华，廖玉华，李留东，等.抗α1-肾上腺素受体抗体介导大鼠心室重塑的免疫机制［J］.中华医学杂志，2005，85(9):625-629.

［5］李正在，廖玉华，周子华，等.高血压患者抗α1肾上腺素受体抗体与心脏重构的临床观察［J］.中华心血管病杂志，2006，34(7):602-604.

［6］Zhou ZH，Liao YH，Wei YM，et al.Cardiac remodeling after long-term stimulation by antibodies against the α1-adrenergic receptor in rats［J］.Clin Immunol，2005，114 (2):164-173.

［7］孙艳香，朱 峰，魏宇淼，等.原发性高血压患者中抗血管紧张素II 1型受体自身抗体所致大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及胞内信号研究［J］.中华高血压杂志，2008，16(9):797-801.

［8］Liao YH，Wei YM，Wang M，et al.Autoantibodies against AT1-receptor and α1-adrenergic receptors in patients with hypertension［J］.Hypertens Res，2002，25 (4):641-646.

［9］Baldwin AS Jr.The NF-κB and IκB proteins:new discoveries and insights［J］.Annu Rev Immunol，1996，14: 649-683.

［10］Schmitz ML，Baeuerle PA.Multi-step activation of NF-κB/Rel transcription factors［J］.Immunobiology，1995，193(2-4):116-127.

［11］Giannini C，Caini P，Giannelli F，et al.Hepatitis C virus core protein expression in human B-cell lines does not significantly modify main proliferation and apoptosis pathways［J］.J Gen Virol，2002，83(Pt 7):1665-1671.

［12］Hinz M，Krappmann D，Eichten A，et al.NF-κB function in growth control:regulation of cyclin D1 expression and G0/G1-to-S-phase transition［J］.Mol Cell Biol，1999，19(4):2690-2698.

［13］孙艳香，廖玉华，朱 峰，等.α1肾上腺素受体1A亚型基因多态性与高血压患者抗α1A肾上腺受体抗体间的关联分析［J］.中华心血管病杂志，2008，36(10): 883-887.

［14］Sun Y，Zhu F，Wang M，et al.Association analysis about HLA-DRB1，-DQB1 polymorphism and auto-antibodies against α1-adrenergic receptors in Chinese patients with essential hypertension［J］.Clin Exp Hypertens，2010，32 (8):532-539.

Activation of NF-κB in rat vascular smooth muscle cells by autoantibodies against α1-adrenergic receptor from hypertensive patients

SUN Yan-xiang1，YUAN Yong1，FENG Li1，LIAO Yu-hua2，ZHU Feng2
(1Department of Cardiovascular Medicine，Zhongshan Hospital，Sun Yat-sen University，Zhongshan 528400，China;2Department of Cardiology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China.E-mail:syx1298509@163.com)

AIM:To study the effects of autoantibodies against α1-adrenergic receptor(α1-AAs)isolated from the hypertensive patients，which showed the agonist-like activity similar to norepinephrine，on the signal mechanism of vascular smooth muscle cells(VSMCs)isolated from rat thoracic aorta.METHODS:Rat VSMCs were cultured and identified.The serum of hypertensive patients was purified by immunoaffinity chromatography.The autoantibodies were detected by ELISA and used to activate the cells with the titer of 1∶80.The total protein was extracted and the expression of NF-κB in different treatment groups was detected by Western blotting.Meanwhile，the activation of NF-κB in the nucleus was analyzed by immunofluorescence method.RESULTS:The expression of NF-κB in VSMCs was obviously higher in α1-AAs group than that in control group.Meanwhile，the expression of NF-κB was inhibited by prasozin and PDTC.The autoantibodies caused a significant increase in NF-κB expression in the nucleus.The fluorescence intensity in α1-AAs group was high than that in control group and α1-AAs+prasozin group(P＜0.01).CONCLUSION:The α1-AAs from hypertensive patients increase NF-κB expression in rat VSMCs.

Hypertension;α1-adrenergic receptors;Autoantibody;NF-kappa B

R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.022

1000-4718(2014)03-0514-04

2013-09-18

2013-12-24

国家自然科学基金资助项目(No.C03030201);中国博士后科学基金资助项目(No.20100470982)

△通讯作者Tel:0760-89880246;E-mail:syx1298509@163.com