阿尔茨海默病小鼠模型中骨髓间充质干细胞的神经分化*

高慧丽， 张广宇， 段冉冉， 李燕飞， 王笑寒， 彭 涛， 关文娟， 贾延劼

(郑州大学第一附属医院神经内科，河南郑州 450052)

阿尔茨海默病小鼠模型中骨髓间充质干细胞的神经分化*

高慧丽， 张广宇， 段冉冉， 李燕飞， 王笑寒， 彭 涛， 关文娟， 贾延劼△

(郑州大学第一附属医院神经内科，河南郑州 450052)

目的：探讨淀粉样前体蛋白(APP)转基因小鼠(阿尔茨海默病小鼠模型)骨髓间充质干细胞(MSCs)的神经分化及其与参与调节干细胞分化的Notch1信号通路的关系，观察分化的骨髓间充质干细胞中自噬的变化。方法：实验分为APP转基因小鼠组(APP组)和野生型小鼠组(WT组)。采用β-巯基乙醇诱导小鼠MSCs分化为神经细胞;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测诱导后β淀粉样蛋白40(Aβ40)和42(Aβ42)的水平;采用免疫细胞化学染色法和Western blotting检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达变化; Western blotting检测Notch1、Notch胞内域(NICD)和Hes5的水平。结果：与野生型小鼠相比，APP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞具有更强的神经分化能力、更高的Aβ表达及更强的Notch1信号抑制。但是，自噬作为神经细胞存活和神经功能必不可少的条件，在分化后的APP转基因小鼠来源的MSCs中受损。结论：过表达APP可能通过抑制Notch-1信号通路增强小鼠骨髓间充质干细胞神经分化的能力，而分化后的APP转基因小鼠MSCs出现自噬通路异常。

淀粉样前体蛋白;骨髓间充质干细胞;Notch1蛋白;神经元;自噬

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以进行性认知功能障碍和行为异常为特征的中枢神经系统退行性病变，是痴呆的最常见类型。对于神经退行性疾病的治疗，除了增加内源性的神经元生成外［1］，干细胞移植也为AD的治疗带来新的希望。已有研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在一些神经系统疾病如神经退行性疾病的治疗中发挥作用［2-3］，其有效的机制可能是细胞替换、提供营养因子、免疫调节等［3-5］。自体骨髓间充质干细胞，因具有易获得和没有免疫排斥反应的特点，可能成为细胞移植的极好选择。为了探讨对于AD患者自体骨髓间充质干细胞的移植能否成功，有必要了解这些细胞在体外的神经分化潜能并探讨其机制。因此本研究选择具有AD特性的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)转基因小鼠［6］作为骨髓间充质干细胞的来源。最近的研究表明，APP能够促进多能干细胞向神经细胞的分化［7］。但是，APP的效果以及其在骨髓间充质干细胞分化中的具体作用还有待于进一步研究。Notch信号通路是在进化过程中一种高度保守的信号转导系统，能够直接调控干细胞的存活、增殖和分化［8］。Notch1信号通路通过抑制神经干细胞的神经分化从而维持神经干细胞的未分化状态。APP和Notch均由γ-分泌酶水解［9］。但是，APP和Notch1信号通路在骨髓间充质干细胞的神经分化过程中是否存在交互作用目前还不十分清楚。自噬是一种非选择性溶酶体途径的自我降解过程，已有研究发现，在神经炎性斑及AD患者脑组织细胞体中存在自噬泡，并且与Aβ的沉积有一定关系［10］。作为可能的AD治疗方法，自体骨髓间充质干细胞的神经分化过程是否存在自噬缺陷仍未可知。因此本研究通过APP转基因小鼠探讨Notch1信号通路在其骨髓间充质干细胞神经分化中作用，并观察分化的骨髓间充质干细胞中自噬的变化。

材料和方法

1 动物

APP转基因小鼠，即过表达人 APP695的K670N/M671L双突变转基因小鼠，由中国医学科学院实验动物科学研究所提供;野生型小鼠是与APP转基因鼠具有相同遗传背景的同窝小鼠。本研究中所有动物的使用均经过郑州大学动物保护委员会同意。

2 主要试剂

DMEM液体培养基、胎牛血清、neurobasal-A培养基和人 β淀粉样蛋白40(amyloid β protein 40，Aβ40)和42(Aβ42)酶联免疫吸附测定试剂盒购自Invitrogen;神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)、Notch1抗体、Notch胞内域(Notch intracellular domain，NICD)抗体、Hes5抗体和β-actin抗体购自Santa Cruz;微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗体和p62抗体购自Cell Signaling;Cy3标记山羊抗兔IgG购自上海碧云天公司;多聚赖氨酸购自Sigma;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1 MSCs分离培养 MSCs从小鼠的胫骨和股骨中分离提取，应用含10%胎牛血清DMEM培养基将其培养于37℃、5%CO2培养箱内。当细胞融合度达到80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化。将细胞传代培养至5代备用。

3.2 实验分组及体外诱导MSCs分化为神经细胞

将获得的MSCs分为2组:APP组(即MSCs取自APP转基因小鼠)，WT组(即MSCs取自野生型小鼠)。当细胞融合度达到50%～70%时，加入预诱导液(即DMEN培养基+20%胎牛血清+1 mmol/L β-巯基乙醇)置于37℃、5%CO2条件下培养24 h，预诱导后将细胞转移至含10 mmol/L β-巯基乙醇的无胎牛血清培养基中并置于37℃、5%CO2条件下培养5d。

3.3 Aβ的检测 应用人Aβ40和Aβ42酶联免疫吸附测定试剂盒(Invitrogen)，参照实验操作说明来检测诱导后Aβ40和Aβ42的水平。

3.4 免疫细胞化学染色法 去除DMEM培养基后，PBS清洗，-20℃ 下在100%甲醇中固定10 min，在含10%正常山羊血清的1%BSA和含0.3 mol/L的0.1%PBST中封闭1 h。加入Ⅰ抗(包括MAP-2抗体、NSE抗体和LC3抗体)4℃过夜。移出Ⅰ抗，PBS清洗3遍，加入Ⅱ抗(Cy3标记山羊抗兔IgG)室温下进行标记染色2 h。应用倒置荧光显微镜观察细胞情况。在随机、双盲的原则下进行统计分析。

3.5 Western blotting 从2组中取等量样品经SDSPAGE分离，转移到PVDF膜上，含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭2 h，加入MAP-2抗体、NSE抗体、Notch1抗体、NICD抗体、Hes5抗体、β-actin抗体、LC3抗体和p62抗体4℃封闭过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温孵育2 h后ECL显影。

3.6 自噬流检测 诱导完成后，将分化的APP组MSCs和WT组MSCs移至神经细胞培养基(neuro-basal-A培养液+2 mmol/L GlutaMAXTM-I+2%B27 +1×105U/L青霉素+100 mg/L链霉素)，并加入10 μmol/L雷帕霉素诱导自噬。用Western blotting分析在不同时点(0 h，6 h，12 h)P62的水平。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1APP组MSCs较WT组MSCs的神经分化效率高

β-巯基乙醇诱导24 h后，MSCs的形态开始发生变化。诱导5 d后，部分细胞胞体收缩呈圆形、锥形，伸出细长突起，多数细胞发生神经元样改变。

免疫细胞化学法和Western blotting检测诱导5 d后神经元标志物NSE和MAP-2在各组间的表达。免疫细胞化学法结果显示APP组细胞NSE和MAP-2的表达显著高于WT组，见图1A。Western blotting得到相似结果，见图1B。

2 已分化MSCs Aβ40和Aβ42的生成

酶联免疫吸附测定结果显示诱导5 d后APP组诱导培养液中Aβ40和Aβ42的浓度分别是(23.2± 3.5)ng/L和(3.3±0.6)ng/L。而在WT组的诱导培养液中未检测到Aβ40和Aβ42。

3 在MSCs分化过程中Notch1信号通路受到抑制

NICD是Notch受体释放的胞内活性部分，Hes5是其下游的靶基因，能够下调原神经基因的表达，从而抑制神经分化［11］。Western blotting结果显示，在诱导前APP组MSCs中Notch1、NICD和Hes5的表达低于WT组，诱导5 d后两组Notch1、NICD和Hes5的表达均显著下降，而已分化的APP组MSCs中Notch1、NICD和Hes5的表达仍低于WT组，见图2。以上结果表明，在MSCs神经分化过程中Notch1信号通路受到抑制。

4 自噬流检测

Western blotting结果显示，在分化后的 APP MSCs较WT MSCs有更高的LC3-II表达(图3B)。免疫荧光结果也显示在分化后的APP MSCs中有LC3阳性荧光点的聚集(图3A)。在APP MSCs诱导过程中p62水平未减少(图3C)，这说明分化后的APP MSCs自噬体成熟障碍。

Figure 1.APP MSCs had higher neural differentiation efficiency than the wild-type(WT)MSCs.The expression of NSE and MAP-2 in MSCs after 5 d of induction by β-ME was measured by immunocytochemical staining(A) and Western blotting(B).Scale bar:20 μm.Mean± SD.n=30.*P＜0.05 vs WT.图1 与野生型小鼠相比，APP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞具有更强的神经分化能力

Figure 2.Notch1 signaling was inhibited during neural differentiation of MSCs from APP mice.Mean±SD.n=30.*P＜0.05 vs WT(before induction);#P＜0.05 vs WT (after induction).图2 在MSCs神经分化过程中Notch1信号通路受到抑制

讨论

MSCs是一种具有多向分化潜能的非造血干细胞，如向骨细胞［12］、软骨细胞、脂肪细胞分化［13］。我们既往的研究发现在体外MSCs能够分化为神经细胞［14-15］。而本研究发现APP转基因小鼠来源的MSCs比野生型MSCs具有更大的向神经元分化的潜能。我们进一步发现在MSCs分化过程中，Notch1、NICD和Hes5表达下降，在APP组MSCs分化过程中下降得更明显。近来有研究发现Hes5是Notch-1信号通路的关键靶基因，而 Notch通路抑制神经分化的作用也依赖于Hes1和Hes5［11，16］。我们的研究进一步确认了Notch1信号通路在MSCs分化为神经元的抑制作用，而APP MSCs较高的神经分化潜能可能与Notch1信号通路抑制有关。

Figure 3.Autophagy flux was impaired in the differentiated APP MSCs.Differentiated APP MSCs and differentiated WT MSCs were cultured in neural culture medium plus 10 μmol/L rapamycin for 0 h，6 h and 12 h.A:LC3-positive staining(red)in MSCs(scale bar:20 μm);B: autophagy-dependent expression of LC3-II in MSCs analyzed using Western blotting;C:p62 expression levels at 0 h，6 h and 12 h were analyzed by Western blotting.Mean±SD.n=30.#P＜0.05 vs WT(6 h).图3 在APP小鼠MSCs神经分化过程中自噬流受损

有研究发现APP胞内域(APP intracellular domain，AICD)通过与胞浆内配体蛋白Numb和Numblike(Nbl)结合抑制 Notch信号通路［17］。Kim等［18］发现AICD能够加速Notch1-IC及RBP-Jk的降解。AICD也可通过分解 Notch1-IC-RBP-Jk复合物进一步抑制Notch1的转录活性。因此AICD作为Notch1信号通路的负向调节因子，可能与MSCs分化过程中APP组Notch1通路较WT组通路抑制明显有关。

Aβ生成及在老年斑中的沉积是AD的早期病理改变［19］。然而最新研究发现Aβ可能还有积极的作用［20］。Jin等［21］发现聚集的Aβ1-40或Aβ1-42和寡聚的Aβ1-42能够促进MSCs神经分化。本研究发现APP组的诱导液中能够检测到Aβ，而在WT组中不能检测到Aβ。因此，高水平的Aβ表达可能与APP MSCs较高的神经分化能力有关。

尽管APP MSCs较高的神经分化潜能为通过自体干细胞移植治疗AD带来希望，但首先要在体外评估分化后的神经元的风险。本研究发现，分化后的APP MSCs中有自噬泡聚集而p62蛋白在分化过程中却没有降解，这提示分化后的APP MSCs自噬体成熟障碍，最终导致自噬途径紊乱。自噬是神经元中蛋白质代谢的主要质控机制，是维持神经元生理功能的必备条件［22］。自噬也涉及到AD的神经退行性变及再生过程。在AD病人的脑中，在神经元突触及突触末端有大量自噬泡聚集［23］。而AD脑中神经元内自噬泡的聚集与淀粉样斑聚集有关［10］。而在分化后的APP MSCs自噬通路异常，因此AD病人不适宜进行MSCs自体移植。

综上所述，本研究发现过表达 APP通过抑制Notch1信号通路从而促进APP MSCs神经分化，而分化后的APP MSCs自噬通路异常。本研究对AD患者进行MSCs自体移植的研究有一定的指示作用，有待于进一步深入研究。

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Neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from an Alzheimer disease mouse model

GAO Hui-li，ZHANG Guang-yu，DUAN Ran-ran，LI Yan-fei，WANG Xiao-han，PENG Tao，GUAN Wen-juan，JIA Yan-jie
(Department of Neurology，The First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China.E-mail: jiayanjie1971@yahoo.com.cn)

AIM:To estimate the neural differentiation efficiency of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs)derived from amyloid precursor protein(APP)transgenic mice and to investigate the correlation with Notch1 signaling and the autophagy activity during the differentiation.METHODS:The MSCs were divided into APP group(MSCs from APP transgenic mice)and WT group(MSCs from wild-type mice).MSCs were treated with β-mercaptoethanol as an inducer for differentiating into neurons.The levels of Aβ40 and Aβ42 were measured using enzyme-linked immunosorbent assay kits.The expression of neural cell-specific markers，neuron-specific enolase(NSE)and microtubule-associated protein 2(MAP-2)，was measured by immunocytochemistry and Western blotting.The expression levels of Notch1，Notch intracellular domain(NICD)，Hes5，LC3 and p62(a selective substrate of autophagy)were also detected by Western blotting.RESULTS:The neural differentiation capacity and the Aβ expression level of the MSCs in APP group were higher than those in WT group，and stronger inhibition of Notch1 signaling pathway in the MSCs from APP group was observed.However，the process of autophagy，which is essential for the survival and function of the neural cells，was impaired in the neural differentiated counterpart of the MSCs in APP group.CONCLUSION:Over-expression of APP might contribute to the high neural differentiation capacity of MSCs by inhibiting Notch1 signaling pathway in vitro.However，autophagy is impaired in the differentiated MSCs from APP transgenic mice.

Amyloid precursor protein;Bone marrow mesenchymal stem cells;Notch1 protein;Neurons;Autophagy

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.015

1000-4718(2014)03-0467-06

2013-11-04

2014-01-09

国家自然科学基金资助项目(No.81071114;No.81371385)

△通讯作者Tel:0371-66862102;E-mail:jiayanjie1971@yahoo.com.cn