参麦注射液对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的干预作用及相关机制探讨

王 岩， 郭永川， 梁前垒， 李朝晖， 董志恒△

(1北华大学病理学与病理生理学教研室，吉林吉林 132021;2吉林大学中日联谊医院神经外二科，吉林长春 130031)

参麦注射液对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的干预作用及相关机制探讨

王 岩1， 郭永川2， 梁前垒2， 李朝晖2， 董志恒1△

(1北华大学病理学与病理生理学教研室，吉林吉林 132021;2吉林大学中日联谊医院神经外二科，吉林长春 130031)

目的：探讨参麦注射液对糖尿病心肌病心肌纤维化的干预作用并初步探讨其机制。方法：将30只Wistar大鼠分为对照组、糖尿病组以及治疗组，每组各10只。采用链脲佐菌素单次腹腔注射的方法制作大鼠糖尿病模型，以枸橼酸缓冲液腹腔注射为对照，治疗组则采用腹腔注射的方式给予参麦注射液干预治疗。采用心室插管对大鼠心功能进行评估;Masson染色观察大鼠心脏组织中胶原水平;二氢乙啶染色观察大鼠心脏组织中活性氧(ROS)水平;Western blotting观察大鼠心肌组织中I型胶原、基质金属蛋白酶2(MMP-2)以及金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)的表达水平。结果：与对照组相比，糖尿病组心功能显著下降(P＜0.05);而治疗组心功能则显著恢复(P＜0.05)。与对照组相比，糖尿病组心肌组织ROS及胶原生成水平显著升高(P＜0.05)，但经参麦注射液治疗后均显著降低(P＜0.05)。与对照组相比，糖尿病组I型胶原及TIMP-2表达水平显著升高(P＜0.05)，而MMP-2水平显著降低(P＜0.05);与糖尿病组相比，治疗组I型胶原及TIMP-2水平显著降低(P＜0.05)，而MMP-2水平则显著升高(P＜0.05)。结论：参麦注射液可能通过抑制氧化应激损伤而减轻糖尿病心肌病心肌纤维化程度。

参麦注射液;糖尿病心肌病;纤维化;氧化性应激

心功能不全是糖尿病的严重并发症，以心肌肥 厚以及心肌纤维化为病理改变特征，心功能恶化常表现为心脏收缩、舒张功能的全面降低以及各种类型的心律失常。这种糖尿病所伴发的特异性心肌病被称为糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［1］。目前研究表明，在体内高糖环境下，葡萄糖对线粒体的持续氧化可导致体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量产生，体内氧化-还原平衡被破坏，进而激活基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)，后者在心肌纤维化、心脏重塑等病理变化中扮演重要的角色［2］。参麦注射液的主要成分为红参及麦冬，具有补心复脉、养阴生津等功效，研究表明其具有一定的抗氧化活性［3］。本研究采用参麦注射液对DCM大鼠模型进行干预，探讨其对DCM产生治疗效果的机制。

材料和方法

1 动物分组及动物模型制作

选择30只6周龄雄性Wistar大鼠作为实验动物进行研究，体重190～220 g。实验动物在22～25℃清洁级实验室中进行分笼饲养，人工照明，12 h昼夜交替1次，大鼠均自由进食、饮水。将大鼠平均随机分为3组，每组10只，分别为对照组、糖尿病组及治疗组。采用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射法制作糖尿病动物模型，STZ(溶解于pH 4.5 0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液中，制成1%STZ溶液)30 mg/kg进行单次腹腔注射，72 h后经由尾静脉取血，测血糖浓度≥16.7 mmol/L视为糖尿病动物模型建立成功。对照组则采用相同剂量的枸橼酸缓冲液进行单次腹腔注射。治疗组在糖尿病动物模型建立成功后，给予参麦注射液(每支10 mL，四川升和药业股份有限公司)8 mL/kg腹腔注射，每天1次，连续注射40 d。

2 观察指标

2.1 心功能检测 本研究心功能检测采用左心室插管对大鼠心功能进行评估。使用器材包括Power-Lab 4/25型生物信息采集系统(AD Instruments);压力换能器(Miller)。首先向大鼠尾静脉内注射肝素(0.3%，2 mg/kg)进行肝素化，然后使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，固定大鼠，颈正中切口钝性分离出右颈总动脉，将远心端活结结扎，钳夹近心端后，将动脉壁剪开一个小口，插入与压力换能器相连的导管，松开结扎线，将导管送入左心室，稳定数分钟后，测定大鼠的左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室压力最大上升或下降速率(left ventricular pressure maximum rise/fall velocity，LV ±dp/dt)。

2.2 心肌组织ROS产生水平 采用脱颈法将大鼠处死，固定4肢，无菌打开胸腔，取出心脏，PBS中轻轻冲洗并挤出心腔内的残血，修剪心脏后置入液氮中速冻。速冻的组织使用 OCT冰冻切片包埋剂(Sakura)进行包埋后，在-20℃下制成厚度为10 μm的连续冰冻切片。采用二氢乙啶(dihydroethidium，DHE;10 μmol/L，碧云天生物技术研究所)对制成的冰冻切片在37℃下孵育45 min，荧光显微镜(Olympus)下进行观察并采集图片，并使用Image-Pro Plus 5.0软件进行分析。

2.3 心肌组织Masson染色 将收集的心脏标本采用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后制成厚度为4 μm的石蜡切片。脱蜡后苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化，洗涤后用丽春红酸性品红溶液染色5 min，迅速水洗后在1%磷钼酸中染色3 min，又在甲苯胺蓝中染色5 min后水洗烘干，树胶封片后观察。采用显微镜(Nikon Eclipse 80i)对所得切片进行观察并经NIS-Elements BR软件进行图像采集。使用Image-Pro Plus软件对获得的图片进行分析，计算胶原纤维染色面积占组织切片面积的分数，即胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)。

2.4 心肌组织I型胶原、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2)表达水平 用Western blotting对心肌组织中I型胶原、MMP-2以及TIMP-2蛋白表达水平进行检测。在冰上将待测组织预冷，将组织剪碎，使用RIPA(Santa Cruz)悬浮组织，在冰上使用匀浆器对组织进行研磨，将匀浆液4℃下82 000 r/min离心45 min，留取上清蛋白，BCA法对获得的蛋白浓度进行测定，向蛋白样本中加入等量1×loading buffer，100℃变性5 min。将样本进行SDS-PAGE电泳，将目的条带电转印法转印至PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭1 h，分别采用兔抗大鼠I型胶原(Abcam)、兔抗大鼠MMP-2 (Santa Cruz)以及兔抗大鼠TIMP-2(Santa Cruz)4℃孵育过夜。充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgGⅡ抗(工作浓度1∶5 000)室温孵育2 h后进行充分洗涤，最后以Super Signal West Pico化学荧光发光试剂盒(Thermo)对检测蛋白进行显影，X胶片曝光后采用Image-Pro Plus 5.0软件分析。

3 统计学处理

用SPSS 18.0软件包分析，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异应比较采用单因素方差分析，以P＜0.05视为差异有统计学意义。

结果

1 各组大鼠心功能比较

与对照组相比，糖尿病组心功能明显受损，表现为LVEDP显著升高，同时LVSP和LV+dp/dt显著降低(P＜0.05);而与糖尿病组相比，治疗组心功能得到改善，表现为LVEDP降低，LVSP和LV±dp/dt显著升高(P＜0.05)，见表1。

表1 各组左心室插管心功能检测结果Table 1.Cardiac function detection in different groups by left ventricular intubation(Mean±SD.n=10)

2 各组大鼠心肌组织ROS水平比较

与对照组相比，糖尿病组大鼠心肌组织内ROS生成水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05);而经过参麦注射液处理的治疗组，心肌组织内ROS水平较糖尿病组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.DHE staining of cardiac tissue from each group(×200).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.图1 各组大鼠心肌组织ROS生成水平比较

3 各组大鼠心肌组织胶原纤维染色

Masson染色见胶原纤维呈现蓝染，正常细胞则呈现红染。对照组心肌细胞排列整齐、致密，心肌细胞间少有胶原纤维;糖尿病组心肌细胞排列松散、紊乱，心肌细胞肥大、肿胀，心肌细胞间及血管周围可见呈堆积状分布的胶原纤维;治疗组心肌细胞排列趋于整齐，肿胀减轻，且胶原纤维成分较糖尿病组明显减少，见图2。

4 各组大鼠心肌组织collagen I、MMP-2及TIMP-2表达

Western blotting发现，与对照组相比，糖尿病组collagen I及TIMP-2表达水平显著升高(P＜0.05)，而MMP-2水平显著降低(P＜0.05);与糖尿病组相比，治疗组collagen I及TIMP-2水平显著降低(P＜0.05)，而MMP-2水平则显著升高(P＜0.05)，见图3。

Figure 2.Masson staining of cardiac tissue in each group(×200).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.图2 各组大鼠心肌组织Masson染色

讨论

在当今社会，随着生活水平的提高及生活方式的改变，2型糖尿病的发病率也呈现逐年显著升高的趋势。糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并发症，其发病与糖尿病的代谢紊乱相关，主要病理改变为心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)堆积、心肌肥厚及心肌间质纤维化等。其中心肌纤维化是糖尿病心肌病的重要特征，心肌间质中胶原大量沉着，能够降低心脏顺应性从而影响心脏的收缩及舒张功能［4］。本研究采用STZ单次腹腔注射的方法制作糖尿病模型，建模成功后采用左心室插管的方法对大鼠心功能进行评估。发现糖尿病大鼠LVEDP显著升高，LVSP和LV ±dp/dt显著降低，说明糖尿病大鼠出现心功能不全，可视为糖尿病心肌病。本研究还通过Masson染色发现，糖尿病组大鼠心肌间质内出现大量胶原堆积，进一步证实糖尿病心肌病伴随心肌间质的胶原堆积伴发心肌纤维化。

MMPs对ECM具有很强的降解作用，MMPs家族中MMP-2与MMP-9属于明胶酶，在心肌组织中表达水平较高，是心肌内抗纤维化的重要成分［5］。TIMPs也为内源性，可对MMPs产生特异性抑制作用，该抑制活性通过其与MMPs共价结合实现，在TIMPs家族中，TIMP-2对MMPs的抑制作用最强。目前研究已经证实，MMP-2表达水平的降低及TIMP-2表达水平的升高参与了糖尿病大鼠心肌纤维化的进程［6］。研究表明，高血糖状态机体内会堆积大量的ROS，后者会对正常组织造成氧化应激损伤。过量产生的ROS在体内能够通过增加核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、转化生长因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等信号通路的活化程度，激活TIMPs/抑制MMPs，从而参与糖尿病心肌病纤维化的发病过程。本研究发现，糖尿病大鼠心肌组织内ROS生成水平显著增加，同时心肌组织胶原含量增加，MMP-2表达水平显著降低，而TIMP-2表达水平显著升高，从而说明MMP-2、TIMP-2参与糖尿病心肌纤维化的过程，但其具体机制仍有待深入探讨。

Figure 3.Expression of collagen I，TMIP-2 and MMP-2 in cardiac tissue from each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.图3 各组大鼠心肌组织I型胶原、MMP-2及TIMP-2的表达

参麦注射液有效成分来源于红参及麦冬2味中药，其有效成分人参皂苷具有清除自由基、抗氧化应激损伤的生物学活性。其中人参皂苷Rg1能够提高体内多种氧化酶的活性，人参皂苷Rb1则能够通过改善微循环、调节皮质醇的分泌等维护体内氧化-还原平衡［7］。本研究对糖尿病大鼠进行参麦注射液腹腔注射，能够显著改善糖尿病大鼠心功能。心脏DHE染色发现其心肌组织内ROS水平较糖尿病大鼠显著降低，Masson染色及I型胶原表达水平降低，表明心肌组织内胶原含量显著下降;同时发现与糖尿病大鼠相比，参麦注射液干预后能使其心肌组织内MMP-2表达水平上升，其抑制剂TIMP-2表达水平下降。从以上结果不难看出，参麦注射液可能是通过其抗氧化活性抑制糖尿病心肌病纤维化的程度，可能通过激活MMPs/抑制TIMPs降低心肌组织胶原含量，从而发挥对糖尿病心脏的保护作用。

［1］黄娅茜，王 宪，孔 炜，等.糖尿病心肌病发病机制的研究进展［J］.生理科学进展，2010，41(1):31-36.

［2］崔 瑾，李德强，邱明才，等.环孢素A对链脲菌素诱导糖尿病大鼠心脏MMP-2和MMP-9表达的影响［J］.中华内分泌代谢杂志，2010，26(3):238-240.

［3］余 健，辛艳飞，宣尧仙.参麦注射液药理作用的物质基础研究进展［J］.医药导报，2013，32(4):497-500.

［4］郑国营.糖尿病心肌病舒张功能不全的研究进展［J］.医学综述，2013，19(9):1647-1649.

［5］Li CJ，Lv L，Li H，et al.Cardiac fibrosis and dysfunction in experimental diabetic cardiomyopathy are ameliorated by alpha-lipoic acid［J］.Cardiovasc Diabetol，2012，11: 73.

［6］Hsia TY，Ringewald JM，Stroud RE，et al.Determinants of extracellular matrix remodelling are differentially expressed in paediatric and adult dilated cardiomyopathy［J］.Eur J Heart Fail，2011，13(3):271-277.

［7］陈 蓉，张春梅，万 英，等.参麦注射液对肾间质纤维化大鼠氧化应激作用研究［J］.现代预防医学，2012，39(10):2542-2543.

Effects of Shenmai injection on myocardial fibrosis in rat model of diabetic cardiomyopathy

WANG Yan1，GUO Yong-chuan2，LIANG Qian-lei2，LI Zhao-hui2，DONG Zhi-heng1
(1Department of Pathology and Pathophysiology，Beihua University，Jilin 132021，China;2Department of Neurosurgery，China-Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130031，China.E-mail:liangqianlei169@sina.com)

AIM:To explore the effects of Shenmai injection on myocardial fibrosis in a rat model of diabetic cardiomyopathy(DCM).METHODS:Wistar rats(n=30)were randomly divided into control group，diabetes group and treatment group.Single intraperitoneal injection of streptozotocin was utilized to establish a rat model of DCM.The rats with DCM in treatment group were intraperitoneally injected with Shenmai injection.Ventricular cannulation was applied to assess the cardiac functions.The formation of collagen in the cardiac tissues was assessed by Masson staining.The generation of reactive oxygen species(ROS)in the cardiac tissues was detected by dihydroethidium staining.The expression levels of matrix metalloproteinase 2(MMP-2)，tissue inhibitor of metalloproteinase 2(TIMP-2)and collagen I in the cardiac tissues were determined by Western blotting.RESULTS:Compared with control group，the cardiac functions were deteriorated in diabetes group(P＜0.05)，which was improved in treatment group as compared with diabetes group(P＜0.05).Compared with control group，the formation of collagen and ROS increased significantly in diabetes group(P＜0.05)，which was decreased in treatment group as compared with diabetes group(P＜0.05).Compared with control group，the expression level of MMP-2 in the cardiac tissues was deceased and TIMP-2 was increased significantly in diabetes group(P＜0.05)，but reversed significantly in treatment group(P＜0.05).CONCLUSION:Shenmai injection attenuates cardiac fibrosis in the rats with DCM by inhibiting the generation of ROS.

Shenmai injection;Diabetic cardiomyopathies;Fibrosis;Oxidative stress

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.012

1000-4718(2014)03-0449-05

2013-08-08

2014-01-14

△通讯作者Tel:0431-84995981;E-mail:liangqianlei169@sina.com