吉非替尼通过增加Foxo3a活性抑制肺纤维化小鼠上皮-间质转分化*

彭 婷， 杜海坚， 李 理， 李伟峰△， 黄文杰

(1南方医科大学研究生学院，广东广州 510515;2广州军区广州总医院呼吸内科，广东广州 510010)

吉非替尼通过增加Foxo3a活性抑制肺纤维化小鼠上皮-间质转分化*

彭 婷1，2， 杜海坚2， 李 理2， 李伟峰2△， 黄文杰2

(1南方医科大学研究生学院，广东广州 510515;2广州军区广州总医院呼吸内科，广东广州 510010)

目的：研究吉非替尼对肺纤维化小鼠转录因子叉头框蛋白O3a(Foxo3a)活性、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平及相关通路的影响，探讨吉非替尼抑制肺上皮-间质转分化的可能机制。方法：将30只SPF级雌性昆明小鼠随机分为3组:对照组(生理盐水气管内雾化)、博来霉素组(博来霉素3 mg/kg溶于100 μL生理盐水气管内雾化)和吉非替尼处理组(博来霉素气管内雾化后，每天吉非替尼20 mg/kg溶于100 μL生理盐水灌胃)。实验第14天收集样本，将小鼠肺组织置于10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片后行HE与Masson染色;RT-PCR法检测Foxo3a和α-SMA mRNA表达水平;Western blotting法检测表皮生长因子受体(EGFR)、Akt、Foxo3a和α-SMA蛋白表达水平。结果：吉非替尼处理组小鼠肺组织病理损伤较博来霉素组明显减轻，胶原沉积明显减少，炎症损伤评分及纤维化评分明显下降(均P＜0.01)，Foxo3a mRNA表达水平明显升高(P＜0.05)，α-SMA mRNA表达水平明显下降(P＜0.05)，总Foxo3a蛋白表达增加，但Foxo3a磷酸化水平显著下降(P＜0.01)，胞核Foxo3a蛋白明显增加(P＜0.05);同时，EGFR和Akt磷酸化水平也显著下降(P＜0.01，P＜0.05)，上皮-间质转分化标志蛋白α-SMA表达水平明显降低(P＜0.05)。结论：吉非替尼抑制博来霉素诱导的肺纤维化，其机制可能与抑制EGFR/Akt通路活化、增强转录因子Foxo3a活性、从而抑制上皮-间质转分化密切相关。

吉非替尼;叉头框蛋白O3a;肺纤维化;博来霉素;上皮-间质转分化

上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)重要的特征改变，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)及其受体(EGF receptor，EGFR)在间质性肺疾病发生、发展中起关键作用［1］，是参与上皮-间质转分化的重要因素［2-3］。前期本实验室的研究发现表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)吉非替尼(gefitinib，Ge)能缓解博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的小鼠肺纤维化，同时下调上皮-间质转分化重要标志——α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，但具体通路及机制尚未阐明［4-5］。

近年研究表明，叉头框蛋白(forkhead box protein，FOX)家族是调控上皮细胞间质转分化的重要转录因子［6］，其重要成员叉头框蛋白O3a(forkhead box protein O3a，Foxo3a)参与纤维化的发生发展［7-8］，而 EGFR/Akt通路可直接调节 Foxo3a活性［9］。于是，本研究建立博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，观察吉非替尼对EGFR/Akt通路、转录因子Foxo3a活性及α-SMA表达水平的影响，探讨吉非替尼抑制肺纤维化中上皮-间质转分化的可能机制。

材料和方法

1 动物

8周龄SPF级雌性昆明小鼠共30只，体重约28 g，广东省医学实验动物中心提供。所有操作和实验流程均遵守《实验动物管理条例》。

2 主要试剂

博来霉素购自浙江海正药业，吉非替尼购自美国阿斯利康公司;Masson染色试剂盒购自福州迈新生物技术公司;PrimeScript RT Master Mix购自宝生物工程有限公司，2×Taq Master Mix购自康为世纪生物科技有限公司;Foxo3a抗体购自江苏碧云天公司，EGFR抗体、p-EGFR抗体、Akt抗体、p-Akt抗体和p-Foxo3a抗体均购自CST，α-SMA抗体和β-actin抗体购自武汉博士德公司，H2A抗体购自SAB;小鼠喉镜、小鼠固定操作台与MicroSprayerTM雾化器来自Penn-Century。所用引物由上海英骏生物技术有限公司根据设计合成。

3 主要方法

3.1 实验设计 30只小鼠随机分为对照组、BLM组和吉非替尼处理(BLM+Ge)组，每组10只。BLM组小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于操作台，以动物喉镜压下小鼠舌根暴露声门，将雾化器从声门插入气管雾化博来霉素溶液(3 mg/kg，100 μL)，对照组雾化等体积生理盐水;BLM+Ge组小鼠雾化BLM后每天给予吉非替尼(20 mg/kg，100 μL)灌胃，对照组与BLM组予相同体积生理盐水灌胃。实验第14天收集标本待测。

3.2 肺组织病理改变 小鼠肺组织以10%中性甲醛固定后，石蜡包埋切片，HE染色及Masson胶原染色，胶原染色操作严格按照Masson染色试剂盒(福州迈新生物技术公司)产品说明书进行。肺损伤程度评分参照Mikawa等［10］的方法、纤维化程度评分参照Ashcroft等［11］的方法进行。

3.3 RT-PCR检测肺组织Foxo3a与α-SMA mRNA表达 按RNAiso Plus试剂盒说明书提取各组小鼠肺组织总RNA，紫外分光光度计定量后稀释成同一浓度(500 mg/L)，进行RT-PCR反应。引物序列为: Foxo3a上游引物5’-CGGACAAACGGCTCACTTT-3’，下游引物5’-TCGGCTCTTGGTGTACTTG-3’;α-SMA上游引物5＇-ACCCAGATTATGTTTGAGACC-3’，下游引物5’-CCGTCAGGCAGTTCGTAG-3’;β-actin上游引物5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’，下游引物5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’。PCR反应条件:94℃预变性5 min，94℃ 40 s，55℃40 s，72℃ 40 s，72℃ 10 min。以β-actin为基准进行相对定量。

3.4 Western blotting检测肺组织EGFR、Akt、Foxo3a和α-SMA 分别提取各组小鼠肺组织总蛋白及胞浆、胞核蛋白，BCA法蛋白定量后，每份蛋白样品取50 μg上样进行SDS-PAGE后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉20 mL室温封闭1.5 h。TBST洗膜后，总蛋白样本分别加入 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、Foxo3a、p-Foxo3a、α-SMA和β-actin抗体，胞核蛋白样本加入Foxo3a抗体和H2A抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的Ⅱ抗37℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL发光试剂检测蛋白印迹条带，吸光度扫描仪扫描胶片，Gelpro32软件分析结果。

4 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，肺组织病理评分用Kruskal-Walis检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 肺组织病理改变

1.1 小鼠肺脏HE染色 对照组小鼠肺组织结构完整，肺泡壁薄，无明显充血及细胞浸润，见图1A;BLM组小鼠肺组织大面积实变，肺泡间隔增厚，间隔内成纤维细胞增多，肺泡内出血，炎症细胞浸润，见图1B; BLM+Ge组小鼠肺泡结构相对完整，少量炎症细胞浸润，见图1C。BLM和BLM+Ge组小鼠肺组织病理评分分别为8.42±1.68和5.44±1.33，BLM+Ge组小鼠肺组织病理评分较BLM组降低，两者均高于对照组(1.10±0.80)，其差异均有统计学意义(n= 5，P＜0.01)。

Figure 1.Pathological changes of lung tissue(HE staining，×200).A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.图1 小鼠肺组织HE染色

1.2 小鼠肺脏Masson染色及纤维化病理评分 对照组肺组织结构完整清晰，未见明显炎症细胞浸润、胶原沉积，见图2A;BLM组小鼠肺组织结构紊乱，肺间质可见渗出、炎症细胞浸润和大量蓝色胶原沉积，见图2B;BLM+Ge组小鼠气道上皮下出现少量炎症细胞浸润，肺泡间隔稍增厚，但结构基本完整，少量蓝色胶原沉积，见图2C。3组小鼠肺组织纤维化病理评分依次为1.46±0.88、8.44±1.80和5.54± 1.32。BLM组评分较对照组显著增加(n=5，P＜0.01)，BLM+Ge组评分较对照组增加，但比BLM组降低(n=5，P＜0.01)。

Figure 2.Pathological changes of lung tissue(Masson staining，×200).A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.图2 小鼠肺组织Masson染色

2 肺组织Foxo3a与α-SMA mRNA的表达水平

BLM组小鼠肺组织Foxo3a mRNA转录水平较对照组降低(P＜0.01);BLM+Ge组小鼠肺组织Foxo3a mRNA转录水平较纤维化组增加(P＜0.05)，见图3。而BLM组小鼠肺组织α-SMA mRNA转录水平较对照组增加(P＜0.05);BLM+Ge组小鼠肺组织α-SMA mRNA转录水平较纤维化组降低(P＜0.05)，见图4。

Figure 3.The RT-PCR analysis for Foxo3a mRNA expression in the lung.A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05 vs B.图3 Foxo3a RT-PCR结果

Figure 4.The RT-PCR analysis for α-SMA mRNA expression in the lung.A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.图4 α-SMA RT-PCR结果

3 肺组织EGFR、Akt、Foxo3a与α-SMA蛋白的表达水平

BLM组小鼠肺组织p-EGFR、p-Akt和p-Foxo3a明显增加(均P＜0.01);BLM+Ge组小鼠肺组织p-EGFR、p-Akt和p-Foxo3a降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)，见图 5。BLM 组小鼠肺组织总蛋白Foxo3a表达水平较对照组及吉非替尼组降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见图5。BLM组小鼠肺组织胞核Foxo3a明显降低，α-SMA明显增加(均P＜0.01);BLM+Ge组小鼠肺组织胞核Foxo3a明显增高，α-SMA明显降低(均P＜0.05)，见图6。

Figure 5.Western blotting for total and phosphorylated protein expression of EGFR，Akt and Foxo3a in the lung.A: control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05，##P＜0.01 vs B.图5 Western blotting检测磷酸化EGFR、Akt和Foxo3a蛋白的表达

讨论

Figure 6.Western blotting for nuclear Foxo3a and total α-SMA protein in the lung.A:control;B:bleomycin;C: bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05 vs B.图6 Western blotting检测肺组织胞核Foxo3a及α-SMA蛋白的表达

目前研究认为上皮细胞损伤后的修复失调是肺间质纤维化关键的病理改变［12-13］，且EGFR参与了上述过程［2-3］。EGFR信号不仅促进上皮细胞向间充质细胞分化，而且延长已转分化的间充质细胞寿命，最终加剧纤维化程度［14］。前期本实验室研究发现使用吉非替尼对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠灌胃后，肺组织EGFR活性显著降低，EMT标志蛋白α-SMA表达减少，小鼠肺部纤维化病理改变明显减轻，Masson染色示气道下胶原沉积明显减少［4-5］，提示抑制EGFR活性能够减轻博来霉素诱导肺纤维化与下调EMT过程密切相关。

近年有研究表明FOX家族可参与纤维化EMT的相关基因调控［6］。FOX蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子，与机体发育、细胞免疫、物质代谢及癌症发生相关。FOXO是FOX家族的一个亚群，具有磷酸化、泛素化、乙酰化等多种修饰方式，其中最主要的修饰方式为磷酸化和去磷酸化。胞核FOXO蛋白去磷酸化为活性形式，磷酸化的FOXO蛋白则失去活性，由胞核转移至胞浆［15］。本研究发现吉非替尼干预后，博来霉素致肺纤维化小鼠转录因子Foxo3a mRNA表达水平增加，胞核Foxo3a蛋白表达增加，相应的磷酸化Foxo3a水平降低，提示吉非替尼可抑制胞浆p-Foxo3a，促进Foxo3a核转位，上调胞核Foxo3a表达水平。同时我们还研究发现，吉非替尼干预后，EGFR和Akt磷酸化水平降低，说明吉非替尼使Foxo3a去磷酸化并入核，可能与抑制EGFR/Akt通路活化密切相关，此与Ganesan等［9］通过EGFR-TKI增加胞核Foxo3a活性致相关细胞因子IL-8表达降低的研究结果一致。

最近有研究表明Foxo3a失活能够促进特发性肺纤维化患者成纤维细胞增殖，同时伴随胶原聚合物的增加［7］，且Foxo3a在转化生长因子β1诱导的上皮-间质转分化相关基因表达调控中起重要作用［8］。本研究发现吉非替尼干预后纤维化程度明显减轻，且代表上皮-间质转化的关键指标α-SMA表达明显减少，与肺组织细胞核中Foxo3a的活性变化相反，提示Foxo3a对肺纤维化上皮-间质转分化起负调控作用。负调控机制在EMT中普遍存在，能够降低EMT相关基因表达以维持机体稳态。

综上所述，EGFR-TKI代表药物吉非替尼通过中断EGFR信号，下调EGFR/Akt通路活性，使Foxo3a进入细胞核，降低上皮-间质转分化标志物α-SMA表达，提示Foxo3a由EGFR/Akt通路调节，在肺纤维化上皮-间质转分化过程中起负调控作用。

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Gefitinib inhibitsepithelial-mesenchymaltransition by up-regulating Foxo3a expression in mice with bleomycin-induced lung fibrosis

PENG Ting1，2，DU Hai-jian2，LI Li，LI Wei-feng2，HUANG Wen-jie2
(1Postgraduate Institute of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Department of Respiratory Medicine，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangzhou 510010，China.E-mail:lwf980622@126.com)

AIM:To identify the effect of gefitinib on the expression of forkhead box protein O3a(Foxo3a)，α-smooth muscle actin(α-SMA)and related signal pathway molecules in the mice with bleomycin-induced lung fibrosis and to investigate the inhibition mechanism of gefitinib on lung epithelial-mesenchymal transition.METHODS:Thirty Kunming female mice were randomly divided into 3 groups:control group(received normal saline intratracheally)，bleomycin group(received bleomycin intratracheally，3 mg/kg)，and bleomycin plus gefitinib group(received bleomycin intratracheally and gefitinib orally，20 mg/kg).All the mice were sacrificed 14 d after the treatments.Pulmonary histological changes were evaluated by hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome staining.The mRNA levels of Foxo3a and α-SMA in the lung tissues were detected by RT-PCR.Nuclear Foxo3a，α-SMA，and phosphorylation of EGFR，Akt and Foxo3a in the lung tissues were determined by Western blotting.RESULTS:Gefitinib inhibited bleomycin-induced lung fibrosis and significantly decreased the scores of lung inflammation and fibrosis.Foxo3a mRNA expression and total Foxo3a protein expression were increased，while the phosphorylated Foxo3a was decreased.Nuclear Foxo3a was increased significantly.Meanwhile，phosphorylated EGFR and Akt were decreased.The level of α-SMA was observably increased.CONCLUSION:Gefitinib restores Foxo3a activity and reduces α-SMA expression by modulating EGFR/Akt activity，thus inhibiting bleomycin-induced lung fibrosis.

Gefitinib;Forkhead box protein O3a;Lung fibrosis;Bleomycin;Epithelial-mesenchymal transition

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.011

1000-4718(2014)03-0444-05

2013-11-01

2014-01-13

广东省自然科学基金资助项目(No.S2011010000511);广东省科技计划项目(No.2010B031600122);广东省自然科学基金资助项目(No.9151001002000014);吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金资助项目(No.320.6750.12330)

△通讯作者Tel:020-88653555;E-mail:lwf980622@126.com