参术冠心颗粒对心肌梗死大鼠冠脉微循环的影响*

徐丹苹， 吴焕林

(广东省中医院心脏中心，广东省中医药科学院，广东广州 510006)

参术冠心颗粒对心肌梗死大鼠冠脉微循环的影响*

徐丹苹， 吴焕林△

(广东省中医院心脏中心，广东省中医药科学院，广东广州 510006)

目的：探讨参术冠心颗粒(SSGX)对大鼠心肌梗死(MI)模型冠脉微循环作用。方法：健康SPF级SD大鼠50只，随机分成假手术(sham)组、MI组、SSGX高剂量、中剂量和低剂量治疗组，每组10只。后4组结扎冠状动脉建立MI大鼠模型，假手术组只穿线不进行结扎。造模3 d后超声检查淘汰不合格大鼠，药物干预4周，测定4周后各组大鼠血清心肌损伤标志物、梗死区中小血管平均血管面密度(MVC值)、梗死边缘区血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达。结果：MI组与sham组比较，光学显微镜见MI组死亡的心肌纤维间空隙变宽，密集的中型多形核白细胞浸润，肉芽组织增生，坏死心肌纤维被致密的胶原纤维取代。超声可见MI组左室室璧活动异常，射血分数减低。心肌钙蛋白T(cTnT)、MVC、PECAM-1和VEGF各指标与sham组比较均有显著差异(P＜0.01)，证明造模成功。大鼠心肌梗死区中小血管的MVC、梗死边缘区PECAM-1及VEGF的表达，SSGX各剂量组与MI组相比表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，呈量效关系。但各SSGX组大鼠和MI组大鼠之间，心肌标志物差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：参术冠心颗粒能改善心肌梗死大鼠冠脉微循环状态，其机制可能与增加PECAM-1和VEGF表达、促进中小血管新生有关。

参术冠心颗粒;心肌梗死;冠脉循环

冠脉血运重建术的发展和成熟虽能重建心外膜的冠脉血流供应，但术后患者的反复心绞痛发作、进行性心功能恶化及冠脉无狭窄患者的客观心肌缺血现象的存在，说明冠脉大血管血运重建并不代表心肌微血管的开放和心肌再灌注的成功，也不能完全解决冠脉微循环功能不全的问题。而冠脉微循环在心肌的血供中起着重要作用，其功能及结构的改变直接影响心脏的功能和代谢。

参术冠心方由七味中药组成。既往临床试验表明，参术冠心颗粒(Shenshuguanxin granula，SSGX)可以降低冠心病心绞痛患者硝酸甘油的使用率，减少心绞痛发作次数，生存治疗提高，改善心功能，改善活动耐量，降低血脂水平等，但对缺血心肌冠脉微循环的作用是否有改善并未明确。本研究拟观察参术冠心方对冠状动脉结扎心肌梗死(myocardial infarction，MI)大鼠模型的冠脉微循环状态的影响，探讨其对改善冠脉微循环可能的作用。

材料和方法

1 动物及分组

健康SPF级SD大鼠50只，体重200～220 g，雄性，由广东省实验动物中心提供。随机分成正常对照组(假手术组)、心肌梗死组(模型组)、参术冠心颗粒高剂量治疗组(高剂量治疗组)、参术冠心颗粒中剂量治疗组(中剂量治疗组)和参术冠心颗粒低剂量治疗组(低剂量治疗组)，每组10只。

2 药物制备

参术冠心颗粒，药物组成:人参，苍术等，由江阴制药集团公司制备成复方颗粒剂成品，颗粒剂成品使用前用水稀释成溶液，3 981.6 mg/kg为高剂量组，1 260 mg/kg为中剂量组，630 mg/kg为低剂量组。

3 模型制作

3.1 手术组(模型组、高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组) 固定动物，麻醉，接呼吸机，插管，开胸暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠脉前降支起始部，距左心耳下缘0.1～0.2 mm处结扎冠状动脉;观察数分钟，彻底止血后逐层关胸。术后肌内注射青霉素钠2×105U/d，每天1次，连续3 d抗感染。

3.2 假手术组 仅在左心耳下缘与肺动脉圆锥间左冠脉前降支位置取同样大小的针缝针而不打结，余操作与手术组同。

3.3 心脏彩超检测造模效果，剔除不合格模型 术后第3天，氯烷吸入麻醉后，通过观察左室心肌的搏动幅度，测量射血分数，剔除手术梗死不满意的模型:梗死面积达不到左室面积30%～40%者剔除、梗死面积超过要求者剔除、发生严重心包积液剔除。

4 给药

各组均予基础饲料饲养。术后第3天开始，假手术组与模型组每日给予5 mL生理盐水灌胃，低、中、高剂量组每天分别给予低、中、高剂量参术冠心颗粒(溶于5 mL注射用水)灌胃，连续4周。

5 血清心肌损伤标志物的测定

完成给药后，开腹，暴露腹主动脉，取血3～4 mL，离心取上层血清测量心肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)的值。

6 梗死区中小血管平均血管面密度

取大鼠心脏左心室，4%多聚甲醛固定24 h，选取乳头肌平面的最大横面进行常规石蜡包埋、HE染色。用Motic B5显微摄像系统200倍光镜视野下心梗区随机选取5个视野，用Image-Pro Plus医学图像分析系统分析，计数中小血管数(microvessel count，MVC)，取平均值，除以视野大小，以mm-2为单位表示微血管面密度。

7 梗死后大鼠梗死边缘区微血管检测——血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1)的免疫组化检测

取梗死心肌与正常心肌的交界处切面，即乳头肌平面外科手术结扎处，制作石蜡标本切片，然后以血管内皮细胞标志物PECAM-1抗体(Santa Cruz)进行免疫组化染色，检测梗死边缘区心肌中毛细血管再生。在高倍镜下(200倍)随机选取5个视野，采用Image-Pro Plus医学图像分析系统计算其IA值，也就是血管密度值，取均值。

8 梗死后大鼠梗死边缘区血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的免疫组化检测

取模型组及参术冠心颗粒高、中、低剂量组大鼠心肌标本，取梗死心肌与正常心肌的交界处切面，即乳头肌平面外科手术结扎处，制作石蜡标本切片，然后以免疫组化法检测梗死边缘区大鼠心肌中VEGF (抗体购自Santa Cruz)表达。在高倍镜下(200倍)随机选取5个视野，采用Image-Pro Plus医学图像分析系统计算其IA值，取其平均值统计分析。

9 统计学处理

采用SPSS 13.0进行统计描述与统计推断，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，统计推断采用One-way ANOVA和LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 HE染色后光学显微镜下心肌观察

取心脏平乳头肌横切面，行HE染色，假手术组可见心肌细胞排列均匀紧密;模型组可见(梗死4周后)死亡的心肌纤维间空隙变宽，密集的中型多形核白细胞浸润，肉芽组织增生，坏死心肌纤维被致密的胶原纤维取代，残留少数的心肌细胞，见图1。

Figure 1.Myocardium with HE staining(×200).A:sham group;B:myocardial infarction(MI)group.图1 假手术组与模型组心肌HE染色

2 假手术组与模型组动物超声心动图对比

动物超声心动图，模型组可见左室室璧活动异常，射血分数减低，假手术组无此现象，见图2。

Figure 2.Representative M-mode echocardiograms of the left ventricle in the parasternal short-axis view.A:sham group;B:myocardial infarction(MI)group.图2 假手术组和模型组心肌超声心动图对比

3 各组大鼠血清心肌损伤标志物的比较

假手术组与模型组的cTnT相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。假手术组与模型组CK、CK-MB、 LDH和AST差异没有统计学意义(P＞0.05)。各手术组cTnT、CK、CK-MB、LDH和AST组间比较均无明显差异(P＞0.05)，见表1。

表1 心肌损伤标志物样本均数及标准差Table 1.Myocardial injury markers in serum of rats(Mean±SD)

4 各组梗死区域心肌中小血管平均密度值对比

在病理图像分析系统下测定各组大鼠心肌梗死边缘区平均血管面密度，见图3。假手术组与模型组的梗死区域心肌中小血管平均密度值相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。其中，参术冠心颗粒高剂量组高于中剂量组和低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.Density of small and medium vessels in myocardial infarction area(HE staining，×200).A:sham group(n=10);B:myocardial infarction(MI)group(n=10);C:MI+SSGX at high dose group(n=10);D:MI+SSGX at middle dose group (n=9);E:MI+SSGX at low dose group(n=9).*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs MI group;#P＜0.05 vs MI+ SSGX at middle dose group or MI+SSGX at low dose group.图3 梗死区域心肌中小血管平均密度值

5 各组大鼠梗死边缘区心肌中微血管PECAM-1蛋白表达

假手术组与模型组的梗死交界处心肌中免疫组化PECAM-1蛋白表达量相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。各手术组梗死交界处心肌中免疫组化PECAM-1蛋白表达量比较:各给药组也明显高于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05);其中，高剂量＞中剂量＞低剂量，见图4。

Figure 4.Expressin of PECAM-1 in the infarct border zone(immunohistochemical staining，×200).A:sham group(n=10);B:myocardial infarction(MI)group(n=10);C:MI+SSGX at high dose group(n=10);D:MI+SSGX at middle dose group (n=9);E:MI+SSGX at low dose group(n=9).*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs MI group;#P＜0.05 vs MI+ SSGX at middle dose group;▲P＜0.05 vs MI+SSGX at low dose group.图4 梗死交界区PECAM-1表达的免疫组化检测

6 各组大鼠梗死边缘区心肌中新生血管VEGF蛋白表达

假手术组与模型组的梗死交界处心肌中VEGF蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05)。参术冠心颗粒中、低剂量组与模型组比较无明显差异(P＞0.05)，高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);其中，高剂量＞中剂量＞低剂量，差异均有统计学意义，见图5。

Figure 5.Expressin of VEGF in the infarct border zone(immunohistochemical staining，×200).A:sham group(n=10);B:myocardial infarction(MI)group(n=10);C:MI+SSGX at high dose group(n=10);D:MI+SSGX at middle dose group (n=9);E:MI+SSGX at low dose group(n=9).*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs MI group;#P＜0.05 vs MI+ SSGX at middle dose group;▲P＜0.05 vs MI+SSGX at low dose group.图5 梗死交界区免疫组化VEGF表达

讨论

冠脉血运重建术的发展和成熟虽能重建心外膜的冠脉血流供应，大大降低冠心病尤其是急性心肌梗死患者的死亡率，但术后患者的反复心绞痛发作、进行性心功能恶化及冠脉无狭窄患者的客观心肌缺血现象说明血运重建治疗并不十分满意。劳力性心绞痛是以大的冠状动脉硬化性狭窄为病理基础的，但微循环扩张功能可能参与修饰缺血的阈值。有研究观察到在冠脉系统内给予内皮来源的NO前体L-arginine，可以预防冠脉狭窄患者由于心率增加而诱发的心肌缺血［1］。因此这些患者发生心肌缺血，不仅存在有大的冠状动脉狭窄，同时也存在冠脉微循环血流调节的异常。

冠脉微循环是由微动脉、毛细血管和微静脉构成的微循环系统，是心脏循环系统最末梢的部分，因其直径较小而冠脉造影看不见。生理情况下，心肌血流量的变化主要由微血管的扩张或收缩来调节。大量研究表明冠脉微血管障碍多和心外膜冠脉病变同时存在，但也常常是一种单独的疾病或状态。所以，血运重建术后患者的反复心绞痛发作、进行性心功能恶化及冠脉无狭窄患者的客观心肌缺血现象说明冠状动脉微循环在心肌的血供中起着重要作用［2］。

微循环障碍的发生，使得已经开通狭窄血管所支配的心肌仍然达不到真正意思上的再灌注，心外膜大血管开通的部分病人生存率并未提高。因此，冠脉微循环改善是心肌存活及功能恢复的前提，是评价再灌注治疗成功与否的关键所在。Gibson等［3］认为冠脉微循环的受损是决定急性心肌梗死的独立危险因素。

参术冠心颗粒是根据国医大师邓铁涛教授调脾护心法治疗冠心病经验总结开发的治疗冠心病的中成药，其有效成分包括人参、苍术等传统中药材，临床研究证实其能减少冠心病患者心绞痛的发作频率和程度、改善生存质量［4-8］。

心肌细胞损伤后因膜的完整性和通透性改变，导致细胞内的大分子生物化学物质逸出，称为心肌标志物。CK和CK-MB在MI后4～6 h即可超过正常上限，24 h达峰值，CK半衰期10～12 h，48～72 h就回落到正常范围。本实验研究结果提示，各组实验组大鼠和对照组大鼠之前，肌钙蛋白和心肌酶都没有明显差异。分析其原因，主要是实验的采血时间，超过了各种心肌标志物在血清的半衰期，所以差异没有统计学意义。

Yokoyama等［9］也发现，如果没有小动脉再生，仅有毛细血管再生，对增加血液供应并无益处，有血流传输功能的小动脉再生是组织存活的前提。本研究结果提示，各组梗死区域心肌中小血管平均密度值对比，与假手术组相比，所有的手术模型心肌梗死区域都会出现不同程度的中小血管增多的表现，这与文献报道的相符，即一旦出现心肌梗死，就会有血管增生的存在。各干预的组间比较:参术冠心颗粒高剂量组高于中剂量组和低剂量组。这说明参术冠心方表现出可以增加梗死区域心肌中小血管平均密度值的作用，且呈量效正相关。

PECAM-1是调控血管内皮细胞凋亡的重要调控因素。它是免疫球蛋白超家族细胞黏附因子中的一种，是参与血小板黏附和聚集的关键因子，有研究发现PECAM-1与临床多种疾病尤其是心血管疾病的发生相关，如动脉粥样硬化，血栓形成;也与多种炎症因子相互作用而调节炎症过程。PECAM-1可以抑制血管内皮细胞的凋亡，是血管内皮细胞的保护性机制之一［10］。由于在发育和成熟个体的所有血管内皮细胞均高度表达PECAM-1，所以PECAM-1常常被用来作为血管内皮细胞的标志物。PECAM-1与血管生成内皮细胞在形成新生血管时，首先发生细胞间接触，增殖以后迁移到血管周围基质，在此重新建立细胞联系并形成新的血管腔［11］。本研究表明，各组大鼠梗死边缘区心肌中微血管PECAM-1蛋白表达免疫组化的对比，各手术组IA值明显高于假手术组，各给药组也明显高于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，参术冠心方高剂量＞中剂量＞低剂量，差异均有统计学意义。这证明参术冠心方对增加各组大鼠梗死边缘区心肌中微血管有作用，参术组表现出明显的剂量依赖性。

VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原，是一种分泌性的糖蛋白，能够促进内皮祖细胞的动员、增殖，并对内皮母细胞具有趋化作用，可促进血管内膜修复及缺血组织的血管新生［12］。Dimmeler等［13］研究发现人正常心脏血管内没有VEGF mRNA及其受体的表达，而在心肌梗死时，在坏死区附近小静脉平滑肌细胞明显高于心肌细胞。这就是我们在该研究中在梗死交界区测定VEGF蛋白表达的原因。关于侧支循环的建立:在冠状动脉狭窄的病人，缺血导致的冠状动脉侧支循环的建立，非常依赖于VEGF表达，建立侧支循环与没有建立侧支循环的心肌比较，其缺氧产生的VEGF mRNA前者显著高于后者，进一步说明心肌缺血时VEGF的高表达可促进侧支循环的建立［14］。而侧支循环的建立是修复梗死心肌、减少心肌梗死面积和维持心功能的重要条件。本研究显示:各手术组VEGF蛋白表达IA值明显高于假手术组，各给药组中，低剂量组与模型组无明显差异(P＞0.05)，其余给药组与模型组差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，高剂量＞中剂量＞低剂量，差异均有统计学意义，说明参术冠心方具有促进血管新生，促进梗死后心脏侧支循环形成的作用。

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［7］吴焕林，罗文杰，黄玉龙.调脾护心法治疗稳定型心绞痛非手术患者的回顾性研究［J］.中国现代医学杂志，2009，19(4):572-574.

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Effect of Shenshuguanxin granula on coronary circulation in rats with myocardial infarction

XU Dan-ping，WU Huan-lin
(Heart Center，Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou 510006，China.E-mail:wuhuanlinboshi@aliyun.com)

AIM:To explore the effect of traditional Chinese medicine Shenshuguanxin granula on coronary circulation in a rat model of myocardial infarction(MI).METHODS:SD rats(n=50，SPF grade)were randomly divided into 5 groups(n=10):sham group，MI group，and high-dose，middle-dose and low-dose Shenshuguanxin granula treatment groups.The rat MI model was established by ligation of the coronary artery.The cardiac markers，small and medium-sized blood vessels［microvessel count(MVC)value］in the infarct zone，and platelet endothelial cell adhesion molecule 1(PECAM-1)and vascular endothelial growth factor(VEGF)expression in the infarct border zone were measured.RESULTS:After 4 weeks of coronary artery ligation，the significant increases in MVC in the infarct zone，and the expression of PECAM-1 and VEGF in the infarct border zone were detected compared with sham group(P＜0.05).The differences of cardiac markers between MI group and other groups were insignificant(P＞0.05).CONCLUSION:Shenshuguanxin granula improves coronary circulation in the rats with myocardial infarction by increasing the expression of PECAM-1 and VEGF，and promoting small and medium-sized angiogenesis.

Shenshuguanxin granula;Myocardial infarction;Coronary circulation

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.010

1000-4718(2014)03-0438-06

2013-12-04

2014-01-09

广东省科学技术厅-广东省中医药科学院联合科研专项(No.2012A032500017)

△通讯作者Tel:020-87351238;E-mail:wuhuanlinboshi@aliyun.com