开唇兰属3种植物总膏的降血糖活性研究*

蔡金艳，朱恩，赵林，张铁，祝晨蔯

(1．广东药学院药科学院，广州 510006；2．广东药学院生命科学与生物制药学院，广州 510006；3．文山学院，文山 663000；4．广州中医药大学临床药理研究所，广州 510006)

开唇兰属3种植物总膏的降血糖活性研究*

蔡金艳1，朱恩1，赵林2，张铁3，祝晨蔯4

(1．广东药学院药科学院，广州 510006；2．广东药学院生命科学与生物制药学院，广州 510006；3．文山学院，文山 663000；4．广州中医药大学临床药理研究所，广州 510006)

目的研究开唇兰属3种药用植物齿唇兰、艳丽齿唇兰和西南齿唇兰的总膏对高糖高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠模型血糖相关指标的影响。方法高血糖实验组大鼠分别灌胃给予3种总膏,测定给药后大鼠血糖、胰岛素敏感性、抗氧化活性及一氧化氮(NO)水平等相关指标。胰腺切片,进行病理学检查。结果与模型组比较,西南齿唇兰总膏组的随机血糖明显降低,由给药前19.3降至8.5 mmol·L-1(P<0.05),而且该组大鼠的体质量明显高于模型组,同时能提高胰岛素敏感性,改善高糖负荷以后的糖耐量。开唇兰属3种植物提取物给药组的超氧化物歧化酶(SOD)活性增加,NO含量均显著降低。结论西南齿唇兰总膏具有良好的降血糖作用,其作用机制可能与改善胰岛素抵抗、增强机体抗氧化活性和降低血浆NO等机制有关。

齿唇兰；艳丽齿唇兰；西南齿唇兰；降血糖；胰岛素敏感指数

云南省文山州常见5种开唇兰属药用植物:花叶开唇兰［Anoectochilus roχburghii(Wall.)Lindl］、滇越金线兰(Anoectochilus chapaensisGagnep.)、齿唇兰(Anoectochilus lanceolatusLindl.)、艳丽齿唇兰［Anoectochilus moulmeinensis(Par.et Rchb.f.) Seidenf.］和西南齿唇兰［Anoectochiluselwesii(Clarke ex Hook.f.)King et Pantl.］。前两种又叫“金线莲”,目前野生资源日渐匮乏,价格昂贵,市场混乱,急切需要科学方法对相关品种进行药用研究［1-4］。齿唇兰、艳丽齿唇兰和西南齿唇兰在民间也常用于治疗糖尿病、肾病等。对金线莲的化学成分和药理活性有较多研究［5-12］,但是齿唇兰、艳丽齿唇兰和西南齿唇兰的报道仅限于物种鉴定［4］、资源调查［13］、组织培养［14］等方面,笔者未见对其降血糖药理活性方面的报道。笔者在本研究考察齿唇兰、艳丽齿唇兰和西南齿唇兰3种植物提取物对2型糖尿病动物模型血糖、胰岛素敏感性、抗氧化能力和一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)的影响,为民间草药资源的综合利用和治疗糖尿病的药物开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养 健康4～5周SPF级雄性SD大鼠60只,体质量80～110 g,购于广东省医学实验动物中心,许可证号:SCXK(粤)2008-0002。饲养环境:室温18～25℃,相对湿度50%～80%,每笼6只,共分10笼,自由采食、饮水,适应饲养10 d。高糖高脂饲料(配方:蛋黄2.5%、蔗糖20%、猪油10%、基础饲料67.5%)喂养4周后,腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)35 mg·kg-1造模。基础料的营养成分符合国标《GB1492413-2001·实验动物·小鼠大鼠配合饲料》的营养标准。

1.2 材料与试剂 西南齿唇兰25 kg、齿唇兰19.75 kg、艳丽齿唇兰全草鲜品12.6 kg,购于云南省文山州。经广东药学院中药学院马鸿雁老师鉴定分别为兰科开唇兰属西南齿唇兰(A.elwesii)、齿唇兰(A. lanceolatus)和艳丽齿唇兰(A.moulmeinensis),原植物凭证标本分别为No.2010-XN1002、2010-CC1003、2010-YL1004,保存于广东药学院药科学院。将药材自然晾干,分别得干品2.6,2.25和1.5 kg,经剪碎后用95%乙醇加热回流提取4次,每次4 h,过滤,回收溶剂,得总膏493.8,622.6和394.5 g。STZ,美国Sigma公司,批号:S0130,临用前用0.1 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH4.4)配成浓度为1%的溶液(10 mg·mL-1)；总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力(批号:20110712)、总抗氧化能力测定试剂盒(批号:20110712)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒(批号:20110712)购于南京建成生物工程研究所。大鼠胰岛素测试盒购自上海蓝基生物试剂公司。阳性药盐酸二甲双胍缓释片(购于双鹤药业有限公司),取3 g溶于去离子水100 mL中,配成30 mg·mL-1备用。怡成超越系列JPS-6型手持式全血葡萄糖测定仪(购于北京怡成生物电子技术有限公司)及专用试纸。尿糖试纸购于广州市花都高尔宝生物技术有限公司。

1.3 高血糖实验大鼠模型的建立 大鼠高糖高脂饲料喂养4周,禁食12 h后,将STZ用0.1 mmol·L-1, pH4.2的无菌柠檬酸缓冲液配制成1%STZ溶液,且避光,冰浴,即用。按35 mg·kg-1腹腔注射STZ造模,继续高糖高脂饮食,观察大鼠饮食量、饮水量、尿量、毛色等情况,2周后测随机血糖,选取血糖>11.1 mmol·L-1者(即成功造模)作为高血糖实验大鼠。

1.4 大鼠分组与给药方法 将高血糖模型大鼠随机分成5组,模型组、阳性药对照组、齿唇兰总膏、艳丽齿唇兰总膏和西南齿唇兰总膏组,每组8只。所有总膏给药剂量折算为生药材均为4 g·kg-1体质量,模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液,阳性对照组每日给予盐酸二甲双胍60 mg·kg-1。连续14 d,每日观察记录体质量、饮食、饮水、垫料,隔日检测尿糖水平,每周检测血糖值(取尾静脉血)。

1.5 观察指标 给药2周后,所有动物禁食过夜,测定空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG)。40%葡萄糖溶液灌胃2.5 g·kg-1,给糖负荷后间隔时间0,30, 60,90,120 min,尾静脉采血测定血糖值,并计算血糖-时间曲线下面积。将所有SD大鼠禁食过夜,3%戊巴比妥(30 mg·kg-1)麻醉大鼠,将鼠仰卧固定于鼠固定板上,剪去胸腹部位的被毛,用75%乙醇消毒皮肤,剪开腹腔,腹主动脉采血,血样置入肝素-锂抗凝真空管中,3 000 r·min-1离心10min(离心机半径15 cm),分离血浆。分别采用相应试剂盒测定血浆胰岛素水平、SOD活力、总抗氧化能力、MDA含量、NO含量。剪开腹腔,位于胃和十二指肠的弯曲处,取胰腺,呈淡红色,形状不规则,似脂肪,用10%甲醛浸泡,固定、染色、镜检,苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察病理组织学变化。胰岛素水平测定采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent serologic assay,ELISA),结合空腹血糖值评价胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI):ISI＝1/(空腹血糖值×空腹胰岛素值)。

2 结果

2.1 血糖相关指标

2.1.1 血糖和体质量 造模前,各实验组大鼠的血糖值平均为(6.5±3.3)mmol·L-1。造模成功后糖尿病大鼠逐渐出现消瘦、精神萎靡、毛色松散灰暗、动作反应迟钝、多饮、多食、多尿等症状。各给药组大鼠随机血糖和体质量的实验结果见表1。给药14 d后,与模型组比较,二甲双胍、西南齿唇兰总膏和齿唇兰总膏组大鼠血糖值降低差异有统计学意义,且西南齿唇兰总膏组大鼠毛色和精神状态都有明显好转,运动量增加,多饮、多食、多尿症状也明显减轻,后期体质量有明显回升。但齿唇兰总膏组体质量明显减轻。

2.1.2 血浆胰岛素敏感指数 开唇兰属3种植物粗提物及二甲双胍均能使模型大鼠的胰岛素敏感指数显著升高,对模型大鼠胰岛素抵抗的改善效果较好。见表2。

2.1.3 糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT) 糖耐量可由血糖-时间曲线评价,结果见图1。

表1 5组大鼠血糖和体质量检测值Tab.1 Determination results of blood glucose and body weight in five groups of rats n＝8,±s

表1 5组大鼠血糖和体质量检测值Tab.1 Determination results of blood glucose and body weight in five groups of rats n＝8,±s

与模型组比较,*1P<0.05Compared withmodel group,*1P<0.05

组别血糖/(mmol·L-1)给药前给药后体质量/g给药前给药后模型组22.8±3.2 19.1±1.4 255.3±42.7 224.9±40.5二甲双胍组18.0±4.5 7.6±1.1*1258.3±35.5 262.5±41.7*1艳丽齿唇兰总膏组19.9±6.3 17.2±5.9 305.6±21.8 336.0±28.7西南齿唇兰总膏组19.3±6.0 8.5±1.4*1297.8±18.7 295.1±32.8*1齿唇兰总膏组22.9±5.4 13.3±6.4*1301.1±17.7 266.9±20.9*1

表2 5组胰岛素敏感指数检测值Tab.2 Determination results of insulin sensitivity index in five groups of rats n＝8，±s

表2 5组胰岛素敏感指数检测值Tab.2 Determination results of insulin sensitivity index in five groups of rats n＝8，±s

与模型组比较,*1P<0.05Compared with model group,*1P<0.05

组别禁食血糖/ (mmol·L-1)血浆胰岛素/ (ng·mL-1)胰岛素敏感指数模型组8.00±0.67 2.233±0.456 0.052±0.012二甲双胍组7.40±0.30 1.637±0.737 0.081±0.014*1艳丽齿唇兰总膏组8.83±1.36 1.487±0.992 0.076±0.034*1西南齿唇兰总膏组7.40±0.47 1.732±0.447 0.078±0.007*1齿唇兰总膏组9.37±1.62 1.010±0.251 0.106±0.023*1

图1 5组大鼠糖耐量试验的血糖-时间曲线

血糖峰值和达峰时间是其中最直观的评价指标。与模型组比较,各给药组对糖耐量均有所改善,其中影响较大的依次是西南齿唇兰总膏组和艳丽齿唇兰总膏组。西南齿唇兰总膏组大鼠在给予糖负荷后血糖约1 h达到峰值,其他组均在0.5 h达到峰值。艳丽齿唇兰总膏组的血糖在0.5 h达到峰值后以较快的速度降低,至1.5 h就基本恢复到糖负荷前的水平。而模型组在0.5 h达到血糖峰值后,血糖值一直处于较高水平。齿唇兰总膏组对模型大鼠的糖耐量未见明显改善。

2.1.4 胰腺组织学检查 各给药组大鼠胰腺组织HE染色的切片图见图2。模型组胰岛细胞团有慢性重度炎症,β细胞可见广泛不可逆性核溶解,灶性细胞坏死,及少量淋巴细胞浸润和广泛小血管充血。开唇兰属3种植物粗提物给药组的胰腺细胞形态较模型组有明显改善。艳丽齿唇兰总膏组细胞核染色较深,可见少量细胞分裂,细胞界限不清,排列无极性；胰岛β细胞有广泛的空泡变性,轻度血管充血,有少量核固缩,未见核溶解(未出现点状坏死及灶性坏死),未见胰岛纤维化,未见淋巴细胞。西南齿唇兰和齿唇兰总膏组胰岛形状饱满,细胞形态较好,细胞核染色较好。细胞数量密集,界限清楚,细胞核较好,核形状正常,有点状坏死(核溶解),有少量分裂增殖,轻度血管充血,未见淋巴细胞浸润。二甲双胍组胰岛细胞团体积明显较大,细胞数量较多,细胞形状不规则,较少见细胞空泡变性,胰岛有轻度血管充血,未见纤维化；胰腺大血管可见有明显充血。

2.2 血浆SOD活性、总抗氧化能力和MDA含量 开唇兰属3种植物提取物给药组的SOD活性显著增加,对总抗氧化活性影响不显著(表3),齿唇兰总膏组的MDA含量显著降低。

2.3 血浆NO含量 如图3所示,开唇兰属3种植物总膏组的NO含量与模型组和二甲双胍组相比均显著降低。

3 讨论

图2 5组大鼠胰腺组织HE染色的切片图(×400)A.艳丽齿唇兰总膏组；B.西南齿唇兰总膏组；C.齿唇兰总膏组；D.二甲双胍组；E.模型组Fig.2 H-E dyeing on pancreas slices of each group of rats(×400)A.total extracts fromA.moulmeinensis；B.total extracts fromA.elwesii；C.total extracts fromA.lanceolatus；D.metformin group；E. model group

表3 5组SOD活性、总抗氧化能力和MDA含量的检测值Tab.3 Determination results of SOD activity,total antioxidant capacity and MDA content in five groups of rats n＝8,±s

表3 5组SOD活性、总抗氧化能力和MDA含量的检测值Tab.3 Determination results of SOD activity,total antioxidant capacity and MDA content in five groups of rats n＝8,±s

与模型组比较,*1P<0.05Compared withmodel group,*1P<0.05

组别SOD 活性总抗氧化能力(U·mL-1) MDA含量/ (nmol·mL-1)模型组453.35±22.00 16.77±9.23 5.00±0.51二甲双胍组463.63±17.21 27.38±2.25*14.84±1.21艳丽齿唇兰总膏组581.43±49.98*118.47±6.37 4.53±0.54西南齿唇兰总膏组535.24±30.15*117.17±6.11 5.90±1.37齿唇兰总膏组629.13±35.47*18.45±0.94 2.73±0.58*1

图3 开唇兰属3种植物总膏对血浆NO含量的影响(n= 8,±s)A.艳丽齿唇兰总膏组;B.西南齿唇兰总膏组;C.齿唇兰总膏组;D.二甲双胍组;E.模型组Fig.3 Effect of three different extracts fromAnoectiochilus on p lasma NO content(n=8,±s)A.total extracts fromA.moulmeinensis;B.total extracts fromA.elwesii;C.total extracts fromA.lanceolatus;D.metformin group; E.model group

本研究采用高糖高脂饮食联合STZ诱导的糖尿病大鼠模型对开唇兰属3种植物总膏进行活性筛选,发现西南齿唇兰总膏显著降低模型大鼠血糖,提高胰岛素敏感性,改善糖耐量,其次是齿唇兰和艳丽齿唇兰总膏。西南齿唇兰中可能含有一些具有良好的降血糖作用的化学成分,有必要对其进行降血糖活性物质基础的进一步研究。从胰岛素敏感性考察结果来看,预示该降血糖作用的发挥可能与改善胰岛素抵抗密切相关。

开唇兰属3种植物提取物给药组的SOD活性显著增加,提示该植物含有增强体内抗氧化活力的成分,而抗氧化作用与高血糖模型的发生和发展有一定的相关性。

HE染色技术检查胰腺组织病理切片镜检实验结果表明,开唇兰属3种植物粗提物给药组的胰腺细胞形态较模型组均有明显改善。造模试剂STZ含有亚硝基,能通过释放NO和增加自由基损伤胰岛β细胞或诱导β细胞凋亡。活性因子NO的测试结果显示给药组对高血糖的改善作用可能与NO含量减少,减轻β细胞损伤有着密切关系,各给药组均能降低模型大鼠血浆NO含量,保护β细胞免受损伤。因此,各给药组NO含量降低有非常重要的生物学意义。关于NO指标的评价与探索药物降血糖的活性机制值得进一步深入研究。NO在脊椎动物中有信号分子的作用,是疏水性较强的胞外小信号分子,很容易通过扩散越过靶细胞质膜,一旦进入胞内就直接调节细胞质中特异蛋白质的活性。有实验证实,小鼠血管平滑肌细胞中的NO可增加蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性［15］。NO可通过PTP1B对胰岛素信号传导下调机制减弱胰岛素刺激细胞的能动性,因此降低NO有助于改善胰岛素抵抗。

［1］中国科学院昆明植物研究所.云南植物志(第十四卷)[M].北京:科学出版社,2003:204.

［2］中国科学院中国植物志编委.中国植物志(第十七卷)[M].北京:科学出版社,2000:220.

［3］张铁,李洪超,刘伟.文山野生金线莲的RAPD鉴别[J].中药材,2009,32(3):347-348.

［4］福建中医药研究所.福建药物志(第二卷)[M].福州:福建科学技术出版社,1982:215.

［5］DU X,SUN N,TAMURA T,et al.Higher yielding isolation of kinsenoside inAnoectochilusand its antihyperliposis effect［J］.Biol PharmBull,2001,24(1):65-69.

［6］何春年,王春兰,郭顺星,等.福建金线莲的化学成分研究[J].中国药学杂志,2005,40(8):581-583.

［7］关憬,王春兰,郭顺星,等.高效液相色谱法测定金线莲中黄酮含量[J].药物分析杂志,2008,28(1):9-11.

［8］何春年,王春兰,郭顺星,等.福建金线莲的化学成分研究I[J].中国中药杂志,2005,30(10):761-763.

［9］关璟,王春兰,郭顺星.福建产金线莲中黄酮苷成分的研究[J].中草药,2005,36(10):1450-1453.

［10］WANG X X,HE JM,WANG C L,et al.Simultaneous structural identification of natural products in fractions of crude extract of the rare endangered plant Anoectochilus roxburghii using H NMR/RRLC-MS[J].Int J Mol Sci, 2011,12(4):2556-2571.

［11］关璟,王春兰,郭顺星,等.福建金线莲总黄酮提取工艺的研究[J].中国药学杂志,2008,43(21):1615-1617.

［12］唐菲,张小琼,徐江涛,等.金线莲降血糖活性部位的筛选[J].中草药,2011,42(2):340-342.

［13］张铁,万京,沐建华.文山地区金线莲种质资源初步调查[J].文山师范高等专科学校学报,2005,18(1):26-28.

［14］张铁,李洪超.西南齿唇兰的组织培养与快速繁殖[J].文山学院学报,2010,23(1):143-144.

［15］SREEIAYAN N,LIN Y,HASSID A.NO attenuate insulin signaling and motility in aortic smooth muscle cells via tyrosine phosphatase1B-mediated mechanism[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(7):1086-1092.

DOI 10.3870/yydb.2014.02.002

Hypoglycemic Effect of Three Different Extracts fromAnoectochilus Genus

CAI Jin-yan1,ZHU En1,ZHAO lin2,ZHANG Tie3,ZHU Chen-chen4
(1.School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou 510006,China;2.School of Life Science and Bio-Pharmaceutical, Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou 510006,China;3.Wenshan University,Wenshan 663000, China;4.Institute of Clinical Pharmacology,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006, China)

Objective To investigate the hypoglycemic effect of 3 different extracts fromAnoectiochilusin diabetic rats induced by high lipid diet plus streptozotocin(STZ).MethodsThe total EtOH extracts were prepared fromA.lanceolatus,A.moulmeinensisandA.elwesii,yielding 3 extracts.Blood glucose(BG),insulin sensitivity index(ISI)and antioxidant activity was assayed.Morphological examination of the pancreas was performed.ResultsThe total extract fromA.elwesiishowed the best profile in hypoglycemic effect and improving insulin sensitivity with a fall of BG from19.3 to 8.5 mmol·L-1(P<0.05).A significant raise in SOD activity and a reduction in plasma NO were observed after the treatment of 3 extracts fromAnoectochilus.ConclusionThe total extract fromA.elwesii shows a good activity in improving glucosemetabolism,whichmay be attributed to increased insulin sensitivity and SOD activity and reduced plasma NO level.

A.lanceolatus;A.moulmeinensis;A.elwesii;Hypoglycemic;Insulin sensitivity index

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)02-0140-05

2013-07-10

2013-09-10

*广东省医学科研基金项目(B2011150)；国家自然科学基金资助项目(81001628)；广东省自然科学基金资助项目(S2013010014771)

蔡金艳(1981-),女,湖北枝江人,副教授,博士,主要从事天然药物活性成分和创新药物研究。电话:(0) 15920107845,E-mail：caijy928@163.com。

赵林(1979-),男,湖北十堰人,讲师,博士,研究方向:生物制药学。电话:020-39352151,E-mail：biozhl@126.com。