阿托伐他汀对急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌IL-6表达的影响*

徐标，曾昆，肖政

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院西区急诊部，武汉 430035)

阿托伐他汀对急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌IL-6表达的影响*

徐标，曾昆，肖政

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院西区急诊部，武汉 430035)

目的探讨阿托伐他汀对急性心肌梗死后慢性心力衰竭的抑制作用及机制。方法45只雄性急性心肌梗死模型大鼠随机均分为阿托伐他汀高、低剂量组及模型组(n＝15)。另取10只大鼠作为假手术组。阿托伐他汀高、低剂量组分别给予阿托伐他汀20,10mg·kg-1·d-1,灌胃6周,假手术组和模型组不予治疗。第6周末以超声心动图检测各组大鼠左心室形态功能变化,测定左室心肌肥厚指数(LVHI)。假手术组取位于左心室游离壁心肌组织,心肌梗死各组取位于左心室梗死区、交界区心肌组织分别以免疫荧光激光共聚焦显微镜及Western blot检测白细胞介素(IL)-6表达。结果模型组、阿托伐他汀高、低剂量组大鼠左室舒张期内径(LVEDD)、左室收缩内径(LVESD)、舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)、LVHI、心肌IL-6水平较假手术组均显著升高(P<0.05或P<0.01);左室射血分数(LVEF)较假手术组降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,高、低剂量阿托伐他汀组大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV、LVHI、心肌IL-6水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),LVEF显著升高(P<0.05或P<0.01)。与阿托伐他汀低剂量组比较,高剂量组大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV、LVHI、心肌IL-6水平均显著降低(P<0.05),LVEF显著升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀可能通过抑制IL-6过度表达而发挥抑制心室重塑作用,其作用呈剂量依赖性。

阿托伐他汀；心肌梗死,急性；心力衰竭,慢性；心室重塑；白细胞介素-6

研究发现阿托伐他汀除具有调脂作用外,还具有其他心血管保护作用,包括改善内皮功能失调、抑制炎症反应、抗血栓形成、稳定斑块等作用［1］,其抑制心室重塑的作用成为近期研究热点。近年来研究表明,炎症细胞因子在急性心肌梗死后心室重塑中发挥重要作用［2］。本研究选择急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)后慢性心力衰竭大鼠为研究对象,观察不同剂量阿托伐他汀对心肌组织中炎症细胞因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的表达变化以及心室重塑程度的影响,探讨阿托伐他汀对AMI后慢性心力衰竭的抑制作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠(动物许可证号:HBDW NO:2008-1015),体质量(250±30)g,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心,于屏障环境中进行饲养和实验。

1.2 药物与试剂 阿托伐他汀(商品名:立普妥,辉瑞制药有限公司,批号:1237175)。兔抗大鼠IL-6单克隆抗体(货号:BA4339-2)、过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(货号:BA1055)、BCA蛋白定量试剂盒(货号:AR0146)均购自武汉博士德生物工程有限公司。电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)试剂盒购自美国Pierce公司,货号:32106。

1.3 动物模型建立及实验分组 按照王薇娜等［3］提供的方法结扎大鼠左冠状动脉前降支制作AMI模型,术后24 h存活45只大鼠,随机均分成模型组和阿托伐他汀高、低剂量组,每组15只。阿托伐他汀高、低剂量组术后第2天起灌胃给药6周,剂量分别为10, 20 mg·kg-1·d-1［4］。另设假手术组10只,仅在左冠状动脉前降支穿线不结扎。假手术组和模型组每日给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。第6周末AMI后心力衰竭模型建立时［5］,模型组、阿托伐他汀高、低剂量组、假手术组大鼠分别存活10,12,11,10只。第6周末大鼠称定质量后以3%戊巴比妥30 mg·kg-1行腹腔麻醉,超声心动图检查后迅速开胸,测定左室心肌肥厚指数(left ventricular hypertrophy index,LVHI)。假手术组取位于左心室游离壁心肌组织,心肌梗死各组取位于左心室梗死区、交界区心肌组织(以结扎线为标志,梗死苍白区边缘至两侧边缘3 mm内)。

1.4 各组大鼠超声心动图检查 腹腔麻醉大鼠后固定、胸部剪毛,鼠台向左倾斜30°,采用彩色多普勒超声诊断仪,将探头放置于胸骨左侧,选取标准左室乳头肌短轴切面和长轴切面在二维影像指导下采用M型超声测量以下指标:左室舒张期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收缩内径(left ventricular end-systole dimension,LVESD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、舒张末期容积(end-diastolic volume,EDV)、收缩末期容积(endsystole volume,ESV)。取3个心动周期的平均值,检测采用双盲法,由本医院超声科专人操作。

1.5 LVHI测定 大鼠麻醉后开胸取出心脏,以冰0.9%氯化钠溶液冲洗干净,滤纸吸干水分。去除大血管、心房、右心室,取左心室称其质量,进行LVHI测定。LVHI＝左室质量/体质量(mg·g-1)。

1.6 白细胞介素(interleukin,IL)-6表达 采用免疫荧光激光共聚焦显微镜(LSCM)观察各组大鼠心肌。取各组大鼠心肌组织制备10μm厚的冰冻切片,组织切片与心肌纵轴平行,经固定、洗脱后以1∶100兔抗大鼠IL-6单克隆一抗孵育过夜,再予1∶100异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的山羊抗兔IgG常温孵育2 h,封片后即在激光共聚焦显微镜下观察,FITC激发波长为492 nm,发射波长为520 nm,切片每张取视野4～6个,选择细胞纵行走向区域进行观察。

1.7 Western blot检测各组心肌组织IL-6表达 取大鼠心肌组织,每份50 mg,匀浆后加入适量组织蛋白裂解液,离心后吸取上清液,按照BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量测定。在电泳仪上用等量蛋白质样品经15%SDS-PAGE分离后,转移于硝酸纤维素膜(poly vinylidene fluoride,PVDF)膜上。以1∶1 000的兔抗大鼠IL-6单克隆一抗4℃静置孵育过夜,再以1∶10 000过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h,在暗室用ECL试剂盒发光显影,同时检测βactin的表达作为内参对照。图片经吸光度图像扫描仪(HP)扫描,以Quantity One软件对结果进行分析,检测各组大鼠心肌组织IL-6与β-actin表达灰度的比值。

2 结果

2.1 各组大鼠超声心动图左室形态功能测定 模型组,阿托伐他汀高、低剂量组大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV较假手术组均显著升高(P<0.05或P< 0.01)；LVEF较假手术组降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,高、低剂量阿托伐他汀组大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV均显著降低(P<0.05或P<0.01), LVEF显著升高(P<0.05或P<0.01)。与低剂量阿托伐他汀组相比,高剂量组大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV均显著降低(P<0.05),LVEF显著升高(P< 0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠LVHI变化 模型组,阿托伐他汀高、低剂量组大鼠较假手术组LVHI明显增高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较,阿托伐他汀高、低剂量组大鼠LVHI明显下降(P<0.05或P<0.01)。阿托伐他汀高剂量组较低剂量组LVHI明显下降(P<0.05),见表2。

表1 4组大鼠超声心动图检测结果Tab.1 Results of u ltrasoundcardiogramin four groups of rats ±s

表1 4组大鼠超声心动图检测结果Tab.1 Results of u ltrasoundcardiogramin four groups of rats ±s

与假手术组比较,*1P<0.05,*3P<0.01;与模型组比较,*2P<0.01,*4P<0.05;与阿托伐他汀高剂量组比较,*5P<0.05Compared with shamoperation group,*1P<0.05,*3P<0.01;compared withmodel group,*2P<0.01,*4P<0.05;compared with highdose atorvastatin group,*5P<0.05

组别大鼠/只LVEDD LVESD mmLVEF/ % EDV ESV mm3阿托伐他汀高剂量组12 5.22±0.42*1*22.24±0.43*1*280.5±3.55*1*20.48±0.13*1*20.11±0.03*1*2低剂量组11 5.79±0.54*3*4*52.80±0.51*3*4*575.8±5.52*3*4*50.67±0.22*3*4*50.20±0.09*3*4*5模型组10 6.31±0.56*33.31±0.52*370.5±5.07*30.78±0.21*30.29±0.07*3假手术组10 4.75±0.31 1.88±0.36 87.5±2.85 0.35±0.14 0.04±0.03

表2 4组大鼠心肌LVHI和IL-6测定Tab.2 Determination of LVHI and IL-6 in cardiac muscle in four groups of rats ±s

表2 4组大鼠心肌LVHI和IL-6测定Tab.2 Determination of LVHI and IL-6 in cardiac muscle in four groups of rats ±s

与假手术组比较,*1P<0.05,*3P<0.01;与模型组比较,*2P<0.01,*4P<0.05;与阿托伐他汀高剂量组比较,*5P<0.05Compared with shamoperation group,*1P<0.05,*3P<0.01; compared with model group,*2P<0.01,*4P<0.05;compared with high-dose atorvastatin group,*5P<0.05

组别例数LVHI/ ×10-3IL-6阿托伐他汀 高剂量组12 1.234±0.143*1*20.116±0.031*1*2低剂量组11 2.442±0.135*3*4*50.191±0.032*3*4*5模型组10 3.656±0.191*30.314±0.027*3假手术组10 0.407±0.031 0.041±0.002

2.3 大鼠心肌IL-6表达部位 模型组、阿托伐他汀高、低剂量组IL-6表达主要在交界区心肌间质,少量分布于心肌细胞内及梗死区间质。假手术组仅细胞间质有微弱IL-6表达。见图1。

2.4 大鼠心肌IL-6表达变化 模型组,阿托伐他汀高、低剂量组大鼠较假手术组心肌IL-6条带表达明显增强(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比,高、低剂量阿托伐他汀组大鼠心肌IL-6条带表达明显减弱(P< 0.01或P<0.05)。阿托伐他汀高剂量组与低剂量组比较,IL-6条带表达明显减弱(P<0.05)。见表2,图2。

3 讨论

IL-6是反映心力衰竭的一个敏感指标,为预后的独立预测因子。慢性心力衰竭患者IL-6水平升高,且IL-6血浆浓度与心功能分级呈正相关［6］。心室重塑是AMI后慢性心力衰竭的主要病变过程。当IL-6与其受体蛋白结合后可导致心肌细胞肥厚后,并能通过NO途径诱导细胞凋亡,因而导致心室重塑［7-8］。IL-6通过p38丝裂原活化蛋白激酶途径介导肌质网功能和心肌收缩力减弱［9］。应用抗IL-6的IgG抗体治疗可使AMI后心室重塑明显减轻［10］。

图1 4组大鼠心肌组织中IL-6的表达(×200)A.假手术组;B.阿托伐他汀高剂量组;C.阿托伐他汀低剂量组;D.模型组Fig.1 IL-6 expression in cardiacmuscle in four groups of rats(×200)A.shamoperation group;B.high-dose atorvastatin group;C.low-dose atorvastatin group;D.model group

图2 Western blot法测定4组大鼠心肌组织IL-6表达A.假手术组;B.阿托伐他汀高剂量组;C.阿托伐他汀低剂量组;D.模型组Fig.2 IL-6 expression in cardiac muscle in four groups of rats by W estern blotA.shamoperation group;B.high-dose atorvastatin group;C. low-dose atorvastatin group;D.model group

研究表明,阿托伐他汀对压力负荷导致的心肌肥厚有明显的保护作用,同时伴有炎性因子水平降低,说明阿托伐他汀的心肌保护作用可能与其抗炎作用有关［11］。阿托伐他汀可以降低核因子-κB等炎症反应重要转录因子的活性,从而发挥抗炎作用［12-13］。笔者在本研究中发现结扎冠脉前降支6周后各组大鼠左心室肥厚、室腔扩大,心功能下降,提示成功构建大鼠慢性心力衰竭模型。模型组,阿托伐他汀高、低剂量组大鼠心肌IL-6表达呈明显梯度变化,随着左心室肥厚、室腔扩大及心功能下降程度的不断加重,IL-6表达水平亦不断增高,表明阿托伐他汀可抑制心肌梗死后心室重塑,减轻心力衰竭程度,其机制可能与其抑制IL-6过度表达相关。阿托伐他汀高剂量组较低剂量组大鼠心力衰竭程度明显减轻,表明阿托伐他汀治疗心肌梗死后慢性心力衰竭的作用可呈剂量依赖性。本研究通过免疫荧光激光共聚焦显微镜观察到各造模组大鼠IL-6主要表达于梗死交界区心肌间质,提示梗死交界区严重的心肌缺血导致的炎症反应加重、诸如IL-6等炎性细胞因子的过度表达在AMI后心室重塑发生、发展过程中发挥着更为重要作用,其具体机制尚需进一步研究。

综上所述,阿托伐他汀独立于调脂作用外的抗炎作用在抑制AMI后慢性心力衰竭发生、发展过程中发挥重要作用,随着研究的进一步深入,其临床作用及其机制将更加丰富,必将成功地应用于急性心肌梗死及其并发症的治疗。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.007

Effect of Atorvastatin on the Expression of Myocardial IL-6 in Rats with Chronic Heart Failure After Acute Myocardial In farction

XU Biao,ZENG Kun,XIAO Zheng
(Department of Emergency Clinic,Puai Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Techology,Wuhan 430035,China)

Objective To investigate the effect and mechanismof atorvastatin on the inhibition of chronic heart failure after acutemyocardial infarction.MethodsForty-fivemale rats with acutemyocardial infarction were divided into high dose atorvastatin group,low dose atorvastatin group and acutemyocardial infarction group(n＝15).Another 10 rats served as shamoperation group.High and low dose atorvastatin group received atorvastatin with 20 mg·kg-1·d-1and 10 mg·kg-1·d-1by gavage for 6 weeks after acutemyocardial infarction.The shamoperation group and the control group received no treatment.At the 6th week,the changes of left ventricularmorphology and function of rats in every group were detected with ultrasonic heartbeat graph.Left ventricular hypertrophy index(LVHI)was determined in every group.The left ventricle free wallmyocardiumin the shamoperation group and the infarction and border zonemyocardiumin myocardial infarction groups were preserved to detect myocardial interleukin-6(IL-6)by immunofluorescence confocalmicroscopy and Western blot.ResultsCompared to the the shamoperation group,there were higher value of left ventricular end-diastolic dimension(LVEDD),left ventricular end-systole dimension(LVESD),end-diastolic volume(EDV),end-systole volume(ESV),LVHI,higher expression levels ofmyocardial IL-6,aswell as lower valuers of left ventricular ejection fraction(LVEF)in themodel group,the groupswith high or low dose atorvastatin(P<0.05 orP<0.01).Compared to the model group,there were lower values of LVEDD,LVESD,EDV,ESV, LVHI,lower expression levels of myocardial IL-6,as well as higher values of LVEF in the groups with high or low dose atorvastatin(P<0.05 orP<0.01).Compared to the the low dose atorvastatin group,there were lower value of LVEDD,LVESD, EDV,ESV,LVHI,lower expression level of myocardial IL-6,as well as higher value of LVEF in the high dose atorvastatin group(P<0.05).ConclusionAtorvastatin may supress ventricular remodeling by inhibiting the over-expression of myocardial IL-6 after acutemyocardial infarction.The effect is dose dependent.

Atorvastatin;Myocardial infraction,acute;Heart failure,chronic;Ventricular remodeling;Interleukin-6

R972.6;R965

A

1004-0781(2014)02-0160-04

2013-04-18

2013-07-16

*武汉市卫生局科研项目(WX12D06)

徐标(1979-),男,湖北武汉人,主治医师,硕士,研究方向:心血管疾病。电话:027-68831420,E-mail：xubiao110@126.com。